इम्यूनोमोड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स् ट्यूमरसूक्ष्मवातावरणस्य (TME) प्रमुखं वैशिष्ट्यं भवति, परन्तु कतिपयान् अपवादान् विहाय तेषां परिचयः बहुधा अज्ञातः एव अस्ति अत्र, वयं उच्चस्तरीयसीरसकार्सिनोमा (HGSC) रोगिणां ट्यूमर-जलोदरयोः ट्यूमरस्य टी-कोशिकानां च विश्लेषणं कृत्वा एतेषां भिन्न-भिन्न-टीएमई-विभागानाम् मेटाबोलोम्-प्रकाशं कृतवन्तः जलोदरस्य अर्बुदकोशिकानां च चयापचयस्य विस्तृतः भेदः भवति । जलोदरस्य तुलने ट्यूमर-प्रवेशकाः टी-कोशिकाः १-मिथाइलनिकोटिनामाइड् (MNA) इत्यनेन महत्त्वपूर्णतया समृद्धाः भवन्ति । यद्यपि टी कोशिकासु एमएनए-स्तरः उन्नतः भवति तथापि निकोटिनामाइड् एन-मिथाइलट्रांसफरेज् (एस-एडेनोसिलमेथियोनिनतः निकोटिनामाइड्-पर्यन्तं मिथाइलसमूहानां स्थानान्तरणं उत्प्रेरकं एन्जाइमम्) इत्यस्य अभिव्यक्तिः रेशेःकोशिकासु ट्यूमरकोशिकासु च सीमितं भवति कार्यात्मकरूपेण एमएनए टी कोशिकानां ट्यूमर-प्रवर्तकं साइटोकाइन् ट्यूमर-नेक्रोसिस-कारकं अल्फा-स्रावं कर्तुं प्रेरयति । अतः TME-व्युत्पन्नः MNA टी कोशिकानां प्रतिरक्षाविनियमने योगदानं ददाति तथा च मानवकर्क्कटस्य चिकित्सायाः सम्भाव्यप्रतिरक्षाचिकित्सालक्ष्यस्य प्रतिनिधित्वं करोति
अर्बुद-व्युत्पन्नचयापचयद्रव्याणां अर्बुदविरोधी प्रतिरक्षायां गहनः निरोधात्मकः प्रभावः भवितुम् अर्हति, अधिकाधिकं प्रमाणं च दर्शयति यत् ते रोगस्य प्रगतेः प्रमुखचालकशक्तिरूपेण अपि कार्यं कर्तुं शक्नुवन्ति (१) वारबर्ग् प्रभावस्य अतिरिक्तं ट्यूमरकोशिकानां चयापचयस्य अवस्थायाः लक्षणं ज्ञातुं तथा च ट्यूमरसूक्ष्मवातावरणस्य (TME) प्रतिरक्षास्थित्या सह तस्य सम्बन्धस्य च अद्यतनकार्यं आरब्धम् अस्ति मूषकमाडलस्य मानवटीकोशिकानां च अध्ययनेन ज्ञातं यत् ग्लूटामाइनचयापचयम् (2), आक्सीडेटिवचयापचयम् (3) ग्लूकोजचयापचयम् (4) च विभिन्नेषु प्रतिरक्षाकोशिकाउपसमूहेषु स्वतन्त्रतया कार्यं कर्तुं शक्नुवन्ति एतेषु मार्गेषु अनेके चयापचयद्रव्याणि टी कोशिकानां अर्बुदविरोधी कार्यं निरुद्धं कुर्वन्ति । एतत् सिद्धं जातं यत् सहएन्जाइमस्य टेट्राहाइड्रोबायोप्टेरिन् (BH4) इत्यस्य नाकाबन्दी टी कोशिकानां प्रसारं क्षतिं कर्तुं शक्नोति, शरीरे BH4 इत्यस्य वृद्ध्या च CD4 तथा CD8 इत्येतयोः मध्यस्थतायां अर्बुदविरोधी प्रतिरक्षाप्रतिक्रिया वर्धयितुं शक्यते तदतिरिक्तं BH4 (5) इत्यस्य प्रशासनेन kynurenine इत्यस्य प्रतिरक्षादमनकारीप्रभावस्य उद्धारः कर्तुं शक्यते । आइसोसाइट्रेट डिहाइड्रोजनेज (IDH) उत्परिवर्तित ग्लियोब्लास्टोमा इत्यस्मिन् एनान्टीओमेटाबोलिक (R)-2-हाइड्रोक्सीग्लूटारेट् (R-2-HG) इत्यस्य स्रावः टी कोशिका सक्रियीकरणं, प्रसारं, कोशिकाविघटनं च गतिविधिं निरुध्यते (6) अद्यतनकाले दर्शितं यत् ग्लाइकोलाइसिसस्य उपोत्पादः मिथाइलग्लाइओक्साल् माइलोइड् मूलस्य दमनककोशिकाभिः उत्पाद्यते, तथा च मिथाइलग्लाइओक्सलस्य टी कोशिकास्थापनं प्रभावकटी कोशिकाकार्यं निरुद्धं कर्तुं शक्नोति उपचारे मिथाइलग्लाइओक्सलस्य निष्प्रभावीकरणं माइलोइड-व्युत्पन्नदमनककोशिकानां (MDSC) गतिविधिं दूरीकर्तुं शक्नोति तथा च मूषकप्रतिरूपेषु चेकपॉइण्ट् नाकाबन्दीचिकित्सां समन्वयात्मकरूपेण वर्धयितुं शक्नोति (7)। एते अध्ययनाः सामूहिकरूपेण टी कोशिकाकार्यं क्रियाकलापं च नियन्त्रयितुं TME-व्युत्पन्नचयापचयद्रव्याणां प्रमुखभूमिकायाः ​​उपरि बलं ददति ।
अण्डकोषकर्क्कटरोगे टी कोशिकाविकारः बहुधा ज्ञातः अस्ति (८) । एतस्य कारणं हाइपोक्सिया-असामान्य-अर्बुद-नाडी-संवहनी (9) इत्येतयोः निहितचयापचय-लक्षणयोः कारणम् अस्ति, यस्य परिणामेण ग्लूकोजस्य ट्रिप्टोफैन्-इत्यस्य च लैक्टिक-अम्ल-क्यनुरेनिन्-इत्यादिषु उपोत्पादेषु परिवर्तनं भवति अत्यधिकं बाह्यकोशिकीयं लैक्टेट् इन्टरफेरोन्-γ (IFN-γ) इत्यस्य उत्पादनं न्यूनीकरोति तथा च मायलोसप्रेसिव उपसमूहानां भेदं चालयति (10, 11) । ट्रिप्टोफैनस्य सेवनेन प्रत्यक्षतया टी कोशिकाप्रसारः निरुद्धः भवति तथा च टी कोशिकाग्राहकसंकेतनं निरुध्यते (१२-१४) । एतेषां अवलोकनानाम् अभावेऽपि, प्रतिरक्षाचयापचयस्य परितः बहु कार्यं अनुकूलितमाध्यमानां उपयोगेन इन विट्रो टी कोशिकासंस्कृतौ कृतम्, अथवा विवो इत्यत्र समरूपमूषकप्रतिरूपेषु सीमितम्, येषु द्वयोः अपि मानवकर्क्कटस्य विषमताम् अपि च शारीरिकं स्थूलं सूक्ष्मं च वातावरणं पूर्णतया प्रतिबिम्बितम् नास्ति
अण्डकोषकर्क्कटस्य सामान्यं लक्षणं पेरिटोनियलप्रसारः, जलोदरस्य प्रादुर्भावः च अस्ति । जलोदरेषु कोशिकाद्रवस्य सञ्चयः उन्नतरोगेण, दुर्बलपूर्वसूचना च सह सम्बद्धः भवति (१५) । रिपोर्ट्-अनुसारं अयं अद्वितीयः विभागः हाइपोक्सिकः अस्ति, संवहनी-अन्तःस्थ-वृद्धिकारकस्य (VEGF) तथा इन्डोलिअमाइन् २,३-डाइऑक्सिजेनेज् (IDO) इत्यस्य उच्चस्तरः अस्ति, तथा च टी-नियामककोशिकाभिः, मायलोइड्-निरोधककोशिकैः च (१५-१८) घुसपैठः भवति जलोदरस्य चयापचयस्य वातावरणं अर्बुदस्य एव भिन्नं भवितुम् अर्हति, अतः पेरिटोनियल-अन्तरिक्षे टी-कोशिकानां पुनः प्रोग्रामिंग् अस्पष्टम् अस्ति तदतिरिक्तं, अर्बुदवातावरणे उपस्थितानां जलोदानां चयापचयद्रव्याणां च प्रमुखभेदाः विषमता च प्रतिरक्षाकोशिकानां घुसपैठं अर्बुदेषु तेषां कार्यं च बाधितुं शक्नुवन्ति, अतः अग्रे संशोधनस्य आवश्यकता वर्तते
एतासां समस्यानां समाधानार्थं वयं संवेदनशीलकोशिकापृथक्करणं तथा द्रववर्णविज्ञानं टैण्डम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) पद्धतिं परिकल्पितवन्तः येन विभिन्नकोशिकाप्रकारानाम् (CD4 + तथा CD8 + T कोशिकानां सहितम्) तथा च ट्यूमरस्य अन्तः तथा च ट्यूमरस्य मध्ये च अध्ययनं भवति वयं उच्च-आयामी-प्रवाह-कोशिकामापनेन सह एककोशिका-आरएनए-अनुक्रमणेन (scRNA-seq) इत्यनेन सह एतस्याः पद्धतेः उपयोगं कुर्मः येन एतेषां प्रमुखजनसंख्यानां चयापचयस्य स्थितिः अत्यन्तं संकल्पितं चित्रं प्रदातुं शक्यते अस्मिन् पद्धत्या ट्यूमर टी कोशिकासु १-मिथाइलनिकोटिनामाइड् (MNA) इत्यस्य स्तरस्य महती वृद्धिः ज्ञाता, तथा च इन् विट्रो प्रयोगेषु ज्ञातं यत् टी कोशिकाकार्यं प्रति MNA इत्यस्य प्रतिरक्षासंशोधकप्रभावः पूर्वं अज्ञातः आसीत् सामान्यतया, एषा पद्धतिः ट्यूमरस्य प्रतिरक्षाकोशिकानां च मध्ये परस्परं चयापचयपरस्परक्रियाः प्रकाशयति, तथा च प्रतिरक्षाविनियमनचयापचयद्रव्याणां विषये अद्वितीयं अन्वेषणं प्रदाति, यत् टी कोशिका-आधारितस्य अण्डकोषकर्क्कटस्य प्रतिरक्षाचिकित्सायाः चिकित्सायाः अवसरानां चिकित्सायाः कृते उपयोगी भवितुम् अर्हति
अस्माभिः उच्च-आयामी-प्रवाह-कोशिका-मापनस्य उपयोगः एकत्रैव ग्लूकोज-उपभोगस्य मात्रां निर्धारयितुं [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) तथा माइटोकॉन्ड्रिया-क्रियाकलापः [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) पार्श्वे पार्श्वे विशिष्टः अस्ति चिह्नानि ये प्रतिरक्षाकोशिकानां ट्यूमरकोशिकाजनसंख्यानां च भेदं कुर्वन्ति (सारणी S2 तथा चित्रं S1A)। अस्मिन् विश्लेषणे ज्ञातं यत् टी-कोशिकानां तुलने जलोदर-ट्यूमर-कोशिकानां ग्लूकोज-उपभोगस्य स्तरः अधिकः भवति, परन्तु माइटोकॉन्ड्रिया-क्रियाकलापस्य लघुः अन्तरः भवति ट्यूमरकोशिकानां [CD45-EpCAM (EpCAM)+] औसतग्लूकोजस्य अवशोषणं T कोशिकानां त्रिगुणं भवति, तथा च CD4 + T कोशिकानां औसत ग्लूकोजग्रहणं CD8 + T कोशिकानां 1.2 गुणा भवति, यत् सूचयति यत् Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) इत्यस्य एकस्मिन् TME इत्यत्र अपि भिन्नाः चयापचयस्य आवश्यकताः सन्ति (चित्रम् 1A) तस्य विपरीतम्, ट्यूमरकोशिकासु माइटोकॉन्ड्रियाक्रियाकलापः CD4 + T कोशिकानां सदृशः भवति, तथा च द्वयोः कोशिकाप्रकारयोः माइटोकॉन्ड्रियाक्रियाकलापः CD8 + T कोशिकानां अपेक्षया अधिकः भवति (चित्रम् 1B) सामान्यतया एते परिणामाः चयापचयस्य स्तरं प्रकाशयन्ति । ट्यूमरकोशिकानां चयापचयक्रियाशीलता CD4 + T कोशिकानां अपेक्षया अधिका भवति, तथा च CD4 + T कोशिकानां चयापचयक्रियाशीलता CD8 + T कोशिकानां अपेक्षया अधिका भवति कोशिकाप्रकारेषु एतेषां प्रभावानां अभावेऽपि, अर्बुदानां तुलने CD4 + तथा CD8 + T कोशिकानां चयापचयस्य स्थितिः अथवा जलनेषु तेषां सापेक्षिकप्रमाणेषु कोऽपि सुसंगतः अन्तरः नास्ति (चित्रम् 1C) तस्य विपरीतम्, CD45-कोशिका-अंशे जलोदरस्य तुलने अर्बुदस्य EpCAM+ कोशिकानां अनुपातः वर्धितः (चित्रम् 1D) । वयं EpCAM+ तथा EpCAM- कोशिकाघटकयोः मध्ये स्पष्टं चयापचयस्य अन्तरं अपि अवलोकितवन्तः। EpCAM+ (ट्यूमर) कोशिकासु EpCAM- कोशिकानां अपेक्षया अधिकं ग्लूकोज-ग्रहणं माइटोकॉन्ड्रिया-क्रियाकलापः च भवति, यत् TME इत्यस्मिन् ट्यूमर-कोशिकासु रेशेदार-कोशिकानां चयापचय-क्रियाकलापात् बहु अधिकम् अस्ति (चित्रम् 1, E तथा F)
(A and B) जलन तथा ट्यूमरतः CD4 + T कोशिकानां (MitoTracker dark red) ग्लूकोज-उपभोगस्य (2-NBDG) (A) तथा माइटोकॉन्ड्रिया-क्रियाकलापस्य माध्य-प्रतिदीप्ति-तीव्रता (MFI) (B) प्रतिनिधि-ग्राफाः (बाम) तथा सारणीबद्ध-आँकडाः (Right), CD8 + T कोशिकानां तथा EpCAM + CD45-ट्यूमर-कोशिकानां। (C) जलोदर-अर्बुदयोः CD4 + तथा CD8 + कोशिकानां (CD3 + T कोशिकानां) अनुपातः। (D) जलोदर तथा ट्यूमर (CD45−) मध्ये EpCAM + ट्यूमर कोशिकाओं का अनुपात। (E and F) EpCAM + CD45-ट्यूमर तथा EpCAM-CD45-मैट्रिक्स ग्लूकोज अवशोषण (2-NBDG) (E) तथा माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि (MitoTracker गहरे लाल) (F) प्रतिनिधि आलेख (बाएं) तथा सारणीबद्ध डेटा ( दक्षिण) जलोदर तथा ट्यूमर कोशिका। (G) प्रवाहकोशिकामापनद्वारा CD25, CD137 तथा PD1 अभिव्यक्तिस्य प्रतिनिधिलेखाः। (H and I) CD4 + T कोशिकासु (H) तथा CD8 + T कोशिकासु (I) CD25, CD137 तथा PD1 अभिव्यक्तिः। (J and K) CCR7 तथा CD45RO इत्यस्य अभिव्यक्तिः आधारितं भोला, केन्द्रीयस्मृतिः (Tcm), प्रभावकः (Teff) तथा प्रभावकस्मृतिः (Tem) फेनोटाइपः। जलन-ट्यूमरयोः CD4 + T कोशिकानां (J) तथा CD8 + T कोशिकानां (K) प्रतिनिधिप्रतिमाः (वामभागे) तथा सारणीबद्धदत्तांशः (दक्षिणतः)। युग्मित टी-परीक्षणेन (* पी <0.05, ** पी <0.01 तथा *** पी <0.001) द्वारा निर्धारित पी मान। रेखा मेलकृतरोगिणः (n = 6) प्रतिनिधित्वं करोति। FMO, प्रतिदीप्तिः माइनस एकं; MFI, माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता।
अग्रे विश्लेषणेन अत्यन्तं समाधानं प्राप्तस्य टी कोशिका फेनोटाइपिकस्थितेः अन्ये महत्त्वपूर्णाः अन्तराः ज्ञाताः । अर्बुदेषु सक्रियः (चित्रम् १, G तः I) तथा प्रभावकस्मृतिः (चित्रम् १, J तथा K) जलनस्य (CD3 + T कोशिकानां अनुपातः) अपेक्षया बहु अधिका भवति तथैव सक्रियताचिह्नानां (CD25 तथा CD137) तथा क्षयचिह्नानां [प्रोग्रामेड सेलमृत्युप्रोटीन 1 (PD1)] इत्यस्य अभिव्यक्तिद्वारा फेनोटाइपस्य विश्लेषणेन ज्ञातं यत् यद्यपि एतेषां जनसंख्यानां चयापचयविशेषताः भिन्नाः सन्ति (चित्रम् S1, B तः E) , परन्तु भोले, प्रभावक वा स्मृति उपसमूहानां मध्ये कोऽपि महत्त्वपूर्णः चयापचयस्य अन्तरः निरन्तरं न अवलोकितः (चित्रम् S1, F तः I)। एतेषां परिणामानां पुष्टिः यन्त्रशिक्षणपद्धतीनां उपयोगेन स्वयमेव कोशिकाफेनोटाइप्स् (21) नियुक्त्य कृता, येन रोगी जलोदरे अस्थिमज्जाकोशिकानां (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) बहूनां संख्यायाः उपस्थितिः अग्रे प्रकाशितवती (चित्रम् S2A) सर्वेषु चिह्नितकोशिकाप्रकारेषु एषा मायलोइड् कोशिकाजनसंख्या सर्वाधिकं ग्लूकोजस्य अवशोषणं माइटोकॉन्ड्रियाक्रियाकलापं च दर्शितवती (चित्रम् S2, B तः G पर्यन्तं) । एते परिणामाः एच् जी एस सी रोगिषु जलोदरेषु तथा अर्बुदेषु दृश्यमानानां बहुकोशिकप्रकारानाम् मध्ये प्रबलं चयापचयात्मकं भेदं प्रकाशयन्ति ।
TIL इत्यस्य मेटाबोनोमिकलक्षणं अवगन्तुं मुख्या चुनौती अस्ति यत् ट्यूमरतः पर्याप्तशुद्धतायाः, गुणवत्तायाः, परिमाणस्य च T कोशिकानां नमूनानां पृथक्करणस्य आवश्यकता अस्ति अद्यतन अध्ययनेन ज्ञातं यत् प्रवाहकोशिकामापनस्य आधारेण क्रमणं, मणिसंवर्धनविधयः कोशिकीयचयापचयप्रोफाइलेषु परिवर्तनं जनयितुं शक्नुवन्ति (22-24) एतस्याः समस्यायाः निवारणाय वयं LC-MS/MS द्वारा विश्लेषणात् पूर्वं शल्यक्रियाद्वारा विच्छेदितमानव अण्डकोषकर्क्कटात् TIL पृथक् कर्तुं पृथक् कर्तुं च मणिसंवर्धनपद्धतिं अनुकूलितवन्तः (सामग्रीः पद्धतयः च पश्यन्तु; चित्रं 2A)। चयापचयपरिवर्तनेषु अस्य प्रोटोकॉलस्य समग्रप्रभावस्य आकलनाय वयं उपर्युक्तस्य मणिपृथक्करणपदस्य अनन्तरं स्वस्थदातृभिः सक्रियितानां टीकोशिकानां चयापचयप्रोफाइलस्य तुलनां तैः कोशिकाभिः सह कृतवन्तः ये मणिपृथक् न आसन् किन्तु हिमे एव तिष्ठन्ति स्म अस्मिन् गुणवत्तानियन्त्रणविश्लेषणे ज्ञातं यत् एतयोः परिस्थितियोः मध्ये उच्चः सहसंबन्धः अस्ति (r = 0.77), तथा च 86 चयापचयद्रव्याणां समूहस्य तकनीकीपुनरावृत्तिक्षमतायां उच्चपुनरावृत्तिक्षमता अस्ति (चित्रम् 2B) अतः एताः पद्धतयः कोशिकाप्रकारस्य समृद्धिम् कुर्वतीषु कोशिकासु सटीकं चयापचयविश्लेषणं कर्तुं शक्नुवन्ति, अतः एचजीएससी-मध्ये विशिष्टचयापचयद्रव्याणां पहिचानाय प्रथमं उच्च-संकल्प-मञ्चं प्रदातुं शक्नुवन्ति, येन जनाः कोशिका-विशिष्टतायाः गहनतया अवगमनं प्राप्तुं समर्थाः भवन्ति यौन-चयापचय-कार्यक्रमः
(A) चुम्बकीय मणि संवर्धन का योजनाबद्ध आरेख। LC-MS/MS द्वारा विश्लेषणात् पूर्वं कोशिकानां चुम्बकीयमणिसंवर्धनस्य क्रमशः त्रयः दौराः भविष्यन्ति अथवा हिमे एव तिष्ठन्ति । (B) चयापचयद्रव्याणां प्रचुरतायां संवर्धनप्रकारस्य प्रभावः। प्रत्येकस्य समृद्धिप्रकारस्य कृते त्रयाणां मापनानां औसतं ± SE. ग्रे रेखा १:१ सम्बन्धं प्रतिनिधियति । अक्षलेबलमध्ये दर्शितस्य पुनरावृत्तिमापनस्य अन्तःवर्गसहसंबन्धः (ICC) । NAD, निकोटिनामाइड एडेनिन डाइनुक्लिओटाइड। (C) रोगी चयापचयविश्लेषणस्य कार्यप्रवाहस्य योजनाबद्धचित्रम्। जलोदरः अथवा अर्बुदः रोगिभ्यः सङ्गृह्य क्रायो-संरक्षितः भवति । प्रत्येकस्य नमूनायाः लघुभागस्य विश्लेषणं प्रवाहकोशिकामापनद्वारा कृतम्, शेषनमूनानां CD4+, CD8+, CD45- कोशिकानां कृते समृद्धीकरणस्य त्रयः दौराः अभवन् एतेषां कोशिकाअंशानां विश्लेषणं LC-MS/MS इत्यस्य उपयोगेन कृतम् । (D) मानकीकृत चयापचयद्रव्यप्रचुरतायां तापनक्शा। डेण्ड्रोग्रामः नमूनानां मध्ये यूक्लिडियनदूराणां वार्डस्य समूहीकरणं प्रतिनिधियति । (E) नमूना मेटाबोलाइट् मानचित्रस्य प्रधानघटकविश्लेषणं (PCA), प्रत्येकस्य नमूनायाः त्रीणि प्रतिकृतयः दर्शयति, एकस्यैव रोगीतः नमूनाः रेखाद्वारा सम्बद्धाः भवन्ति। (F) रोगी (अर्थात् आंशिक-अतिरिक्ततायाः उपयोगेन) कण्डिशन्ड् नमूनायाः चयापचय-प्रोफाइलस्य PCA; नमूनाप्रकारः उत्तलपटलेन सीमितः भवति । पीसी१, मुख्यघटकः १; PC2, मुख्य घटक 2.
तदनन्तरं वयं षट् HGSC रोगिणां प्राथमिकजलोदरेषु ट्यूमरयोः च CD4 +, CD8 + तथा CD45-कोशिका-अंशेषु 99 चयापचयद्रव्याणां विश्लेषणार्थं एतां समृद्धीकरणपद्धतिं प्रयुक्तवन्तः (चित्रं 2C, चित्रं S3A तथा च सारणी S3 तथा S4)। जीवितकोशिकानां मूलबृहत्नमूनायाः २% तः ७०% पर्यन्तं रुचिजनसंख्या भवति, कोशिकानां अनुपातः रोगिणां मध्ये बहु भिद्यते मणिपृथक्करणानन्तरं व्याजस्य समृद्धः अंशः (CD4+, CD8+ अथवा CD45-) नमूनायां सर्वेषां जीवितकोशिकानां औसतेन 85% अधिकं भवति एषा समृद्धिविधिः अस्मान् मानवस्य अर्बुद ऊतकचयापचयात् कोशिकाजनसंख्यानां विश्लेषणं कर्तुं शक्नोति, यत् बृहत् नमूनाभ्यः कर्तुं असम्भवम् अस्ति । अस्य प्रोटोकॉलस्य उपयोगेन वयं निर्धारितवन्तः यत् l-kynurenine तथा adenosine, एतौ सुलक्षणयुक्तौ प्रतिरक्षादमनकारी चयापचयौ ट्यूमर टी कोशिकासु अथवा ट्यूमरकोशिकासु उन्नतौ स्तः (चित्रम् S3, B तथा C)। अतः एते परिणामाः अस्माकं कोशिकापृथक्करणस्य तथा द्रव्यमानवर्णक्रममापनप्रौद्योगिक्याः निष्ठां क्षमतां च दर्शयन्ति यत् रोगी ऊतकयोः जैविकरूपेण महत्त्वपूर्णचयापचयद्रव्याणि अन्वेष्टुं शक्नोति।
अस्माकं विश्लेषणेन रोगिणां अन्तः तथा च मध्ये कोशिकाप्रकारस्य सशक्तं चयापचयपृथक्करणं अपि ज्ञातम् (चित्रं 2D तथा चित्रं S4A)। विशेषतः अन्येषां रोगिणां तुलने रोगी ७० भिन्नानि चयापचयलक्षणं दर्शितवान् (चित्रं २E तथा चित्रं S4B), यत् सूचयति यत् रोगिणां मध्ये पर्याप्तं चयापचयविषमता भवितुम् अर्हति ज्ञातव्यं यत् अन्येषां रोगिणां (१.२ तः २ लीटरपर्यन्तं; सारणी S1) तुलने ७० रोगिषु (८० मि.ली.) संगृहीतस्य जलोदरस्य कुलमात्रा न्यूना आसीत् मुख्यघटकविश्लेषणस्य समये अन्तर-रोगीविषमतायां नियन्त्रणं (उदाहरणार्थं, आंशिक-अतिरिक्तता-विश्लेषणस्य उपयोगेन) कोशिकाप्रकारयोः मध्ये सुसंगतं परिवर्तनं दर्शयति, तथा च कोशिकाप्रकाराः/वा सूक्ष्मवातावरणं चयापचयप्रोफाइलस्य अनुसारं स्पष्टतया एकत्रिताः भवन्ति (चित्रम् 2F) एकचयापचयद्रव्याणां विश्लेषणेन एतेषु प्रभावेषु बलं दत्तं तथा च कोशिकाप्रकारस्य सूक्ष्मवातावरणस्य च मध्ये महत्त्वपूर्णाः अन्तराः प्रकाशिताः । ज्ञातव्यं यत् अत्यन्तं चरमः अन्तरः MNA इति अवलोकितः, यः प्रायः CD45- कोशिकासु तथा च CD4+ तथा CD8+ कोशिकासु समृद्धः भवति ये अर्बुदस्य अन्तः प्रविष्टाः भवन्ति (चित्रम् 3A) CD4 + कोशिकानां कृते एषः प्रभावः सर्वाधिकं स्पष्टः भवति, CD8 + कोशिकासु MNA अपि पर्यावरणेन प्रबलतया प्रभावितः इति दृश्यते । परन्तु एतत् महत्त्वपूर्णं नास्ति, यतः षट् रोगिणां मध्ये केवलं त्रयः एव ट्यूमरस्य CD8+ स्कोरस्य मूल्याङ्कनं कर्तुं शक्यन्ते । MNA इत्यस्य अतिरिक्तं जलोदरेषु अर्बुदेषु च विभिन्नेषु प्रकारेषु कोशिकासु अन्ये चयापचयद्रव्याणि ये TIL इत्यस्मिन् दुर्बललक्षणं भवन्ति ते अपि भिन्नरूपेण समृद्धाः भवन्ति (चित्रम् S3 तथा S4) अतः एते आँकडा: अग्रे संशोधनार्थं प्रतिरक्षानियंत्रकचयापचयद्रव्याणां आशाजनकं समुच्चयं प्रकाशयन्ति ।
(A) जलोदरात् ट्यूमरतः च CD4+, CD8+ तथा CD45- कोशिकासु MNA इत्यस्य सामान्यीकृतसामग्री। पेटीप्लॉट् मध्ये मध्यचतुर्थांशपरिधिः (फ्रेम हिन्ज) तथा च आँकडापरिधिः दर्शितः अस्ति, अन्तरचतुर्थांशपरिधिः (फ्रेम मूंछः) १.५ गुणान् यावत् यथा रोगीसामग्रीविधिषु वर्णितं, पी मूल्यं (*P<0.05 तथा **P<0.01) निर्धारयितुं रोगी लिम्मा मूल्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु। (B) MNA चयापचय का योजनाबद्ध आरेख (60)। चयापचय पदार्थ: एस-एडेनोसाइल-1-मेथियोनिन; SAH, एस-एडेनोसिन-1-होमोसिस्टीन; NA, निकोटिनामाइड; एमएनए, 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड; 2-PY, 1-मिथाइल- 2-पिरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; 4-PY, 1-मिथाइल-4-पिरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; एन आर, निकोटिनामाइड राइबोज; एन एम एन, निकोटिनामाइड मोनोन्यूक्लिओटाइड। एन्जाइम (हरे): एनएनएमटी, निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़; SIRT, सिर्टुइन्स; NAMPT, निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसाइल ट्रांसफरेज़; AOX1, एल्डीहाइड ऑक्सीडेज 1; एनआरके, निकोटिनामाइड राइबोसाइड किनेज़; NMNAT, निकोटिनामाइड मोनो न्यूक्लियोटाइड एडेनिलेट ट्रांसफरेज़; Pnp1, प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज। (C) जलोदर (ग्रे) तथा ट्यूमर (लाल; n = 3 रोगियों) के scRNA-seq के t-SNE। (D) scRNA-seq इत्यस्य उपयोगेन चिह्नितेषु विभिन्नेषु कोशिकाजनसंख्यासु NNMT अभिव्यक्तिः। (E) SK-OV-3, मानवभ्रूणगुर्दा (HEK) 293T, T कोशिकासु तथा MNA-उपचारित T कोशिकासु NNMT तथा AOX1 इत्येतयोः अभिव्यक्तिः। गुटितव्यञ्जनं SK-OV-3 इत्यस्य सापेक्षतया दर्शितम् अस्ति । SEM इत्यनेन सह अभिव्यक्तिप्रतिमानं दर्शितं (n = 6 स्वस्थदातारः)। ३५ तः अधिकानि Ct मूल्यानि अज्ञातानि (UD) इति मन्यन्ते । (F) 8mM MNA इत्यनेन उपचारितेषु SK-OV-3, HEK293T, T कोशिकासु तथा T कोशिकासु SLC22A1 तथा SLC22A2 इत्यस्य अभिव्यक्तिः। गुटितव्यञ्जनं SK-OV-3 इत्यस्य सापेक्षतया दर्शितम् अस्ति । SEM सह अभिव्यक्तिप्रतिमानं दर्शितं (n = 6 स्वस्थदातारः)। ३५ तः अधिकानि Ct मूल्यानि अज्ञातानि (UD) इति मन्यन्ते । (G) MNA सह 72 घण्टानां ऊष्मायनस्य अनन्तरं सक्रियस्वस्थदातृटी कोशिकासु कोशिका MNA सामग्री। SEM इत्यनेन सह अभिव्यक्तिप्रतिमानं दर्शितं (n = 4 स्वस्थदातारः)।
एमएनए निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़ (NNMT; चित्र 3B) द्वारा एस-एडेनोसाइल-1-मेथियोनिन् (SAM) तः निकोटिनामाइड (NA) मध्ये मिथाइल समूहं स्थानान्तरयित्वा निर्मितं भवति एनएनएमटी विभिन्नेषु मानवकर्क्कटेषु अतिअभिव्यक्तं भवति तथा च प्रसारः, आक्रमणं, मेटास्टेसिसः च सह सम्बद्धः भवति (२५-२७) । TME इत्यस्मिन् टी कोशिकासु MNA इत्यस्य स्रोतः अधिकतया अवगन्तुं वयं त्रयाणां HGSC रोगिणां जलोदरेषु ट्यूमरेषु च कोशिकाप्रकारेषु NNMT इत्यस्य अभिव्यक्तिं लक्षणं ज्ञातुं scRNA-seq इत्यस्य उपयोगं कृतवन्तः (सारणी S5)। प्रायः ६,५०० कोशिकानां विश्लेषणेन ज्ञातं यत् जलोदर-ट्यूमर-वातावरणेषु एनएनएमटी-अभिव्यक्तिः अनुमानित-रेशे-कोशिका-जनसंख्यासु तथा ट्यूमर-कोशिका-जनसंख्यासु प्रतिबन्धिता आसीत् (चित्रम् ३, सी, डी च) ज्ञातव्यं यत् पीटीपीआरसी (CD45 +) (चित्रं 3D तथा चित्रं S5A) अभिव्यञ्जयति इति कस्मिन् अपि जनसंख्यायां एनएनएमटी-अभिव्यक्तिः स्पष्टा नास्ति, यत् सूचयति यत् चयापचय-वर्णक्रमे ज्ञातः एमएनए टी-कोशिकासु प्रविष्टः अस्ति एल्डीहाइड आक्सीडेज १ (AOX1) इत्यस्य अभिव्यक्तिः MNA इत्यस्य १-मिथाइल-२-पिरिडोन्-५-कार्बोक्सामाइड् (२-PYR) अथवा १-मिथाइल-४-पिरिडोन्-५-कार्बोक्सामाइड् (४- PYR) इत्यत्र परिवर्तयति चित्र 3B) COL1A1 (चित्रं S5A) अभिव्यक्तं कुर्वतां रेशेनकोशिकानां जनसंख्यायां अपि प्रतिबन्धितम् अस्ति, ये मिलित्वा सूचयन्ति यत् T कोशिकासु पारम्परिक MNA चयापचयस्य क्षमतायाः अभावः अस्ति एतेषां MNA-सम्बद्धानां जीनानां अभिव्यक्तिप्रतिमानं HGSC रोगिभ्यः जलोदरात् द्वितीयस्वतन्त्रकोशिकादत्तांशसमूहस्य उपयोगेन सत्यापितं (चित्रं S5B; n = 6) (16)। तदतिरिक्तं, MNA इत्यनेन उपचारितानां स्वस्थदातृ-टी-कोशिकानां मात्रात्मक-पॉलिमरेज-शृङ्खला-प्रतिक्रिया (qPCR)-विश्लेषणेन ज्ञातं यत् नियन्त्रण-एसके-ओवी-3 अण्डकोष-ट्यूमर-कोशिकानां तुलने एनएनएमटी अथवा एओएक्स१ प्रायः अभिव्यक्तः नासीत् (चित्रम् ३ ई) एते अप्रत्याशितपरिणामाः सूचयन्ति यत् MNA रेशेदारात् अथवा अर्बुदात् TME इत्यस्मिन् समीपस्थेषु T कोशिकासु स्रावितः भवितुम् अर्हति ।
यद्यपि अभ्यर्थीषु घुलनशीलवाहक 22 (SLC22) परिवारेण (SLC22A1, SLC22A2 तथा SLC22A3) संकेतितस्य कार्बनिककटियनपरिवहनकानां 1 तः 3 (OCT1, OCT2 तथा OCT3) परिवारः अन्तर्भवति, तथापि MNA इत्यस्य सम्भाव्यपरिवहनकर्तारः अद्यापि अपरिभाषिताः सन्ति (28) स्वस्थदाता टी कोशिकाभ्यः mRNA इत्यस्य QPCR इत्यनेन SLC22A1 इत्यस्य न्यूनव्यञ्जनस्तरः परन्तु SLC22A2 इत्यस्य अज्ञातस्तरः दर्शितः, येन पुष्टिः अभवत् यत् पूर्वं साहित्ये (चित्रं 3F) (29) अस्य सूचना दत्ता आसीत् तस्य विपरीतम्, SK-OV-3 अण्डकोषस्य ट्यूमरकोशिकारेखा द्वयोः परिवहनकर्तृयोः उच्चस्तरं व्यक्तवती (चित्रम् 3F) ।
विदेशीय-एमएनए-शोषणस्य क्षमतायाः टी-कोशिकानां सम्भावनायाः परीक्षणार्थं स्वस्थ-दातृ-टी-कोशिकानां एमएनए-विभिन्न-सान्द्रतायाः उपस्थितौ ७२ घण्टापर्यन्तं संवर्धितम् बहिर्जातीय-एमएनए-अभावे एमएनए-कोशिकीयसामग्री ज्ञातुं न शक्यते (चित्रम् ३जी) । परन्तु बहिर्जातीय-एमएनए-इत्यनेन उपचारित-सक्रिय-टी-कोशिकासु कोशिकासु एमएनए-सामग्रीयां मात्रा-निर्भर-वृद्धिः दर्शिता, 6 mM MNA पर्यन्तं (चित्रम् 3G) एतत् परिणामं सूचयति यत् परिवहनकर्तृव्यञ्जनस्य न्यूनस्तरस्य अपि च अन्तःकोशिकीय-एमएनए-चयापचयस्य उत्तरदायी मुख्य-एन्जाइमस्य अभावेऽपि टीआईएल अद्यापि एमएनए-ग्रहणं कर्तुं शक्नोति
रोगिणां टी कोशिकासु चयापचयद्रव्याणां स्पेक्ट्रमः तथा च इन विट्रो एमएनए अवशोषणप्रयोगेषु एतत् संभावना वर्धते यत् कर्करोगसम्बद्धाः रेशेः (CAF) एमएनए स्रावं कुर्वन्ति तथा च ट्यूमरकोशिका TIL इत्यस्य फेनोटाइपं कार्यं च नियन्त्रयितुं शक्नुवन्ति टी कोशिकासु एमएनए-प्रभावं निर्धारयितुं एमएनए-सन्निधौ अथवा अनुपस्थितौ स्वस्थदातृ-टी-कोशिकानां विट्रो-रूपेण सक्रियीकरणं कृतम्, तेषां प्रसारस्य साइटोकाइन्-उत्पादनस्य च मूल्याङ्कनं कृतम् अधिकतममात्रायां MNA योजयित्वा ७ दिवसेभ्यः अनन्तरं जनसंख्यायाः दुगुणीकरणसङ्ख्या मध्यमरूपेण न्यूनीकृता, यदा तु सर्वेषु मात्रासु ओजः स्थापितः (चित्रम् ४ क) तदतिरिक्तं बहिर्जातीय-एमएनए-चिकित्सायाः परिणामेण ट्यूमर-परिगलनकारक-α (TNFα; चित्रं 4B) अभिव्यक्तुं CD4 + तथा CD8 + T कोशिकानां अनुपातस्य वृद्धिः अभवत् तस्य विपरीतम्, CD4 + T कोशिकासु IFN-γ इत्यस्य अन्तःकोशिकीयं उत्पादनं महत्त्वपूर्णतया न्यूनीकृतम्, परन्तु CD8 + T कोशिकासु न, तथा च इन्टरल्यूकिन् 2 (IL-2; चित्रम् 4, C तथा D) इत्यत्र कोऽपि महत्त्वपूर्णः परिवर्तनः नासीत् अतः एतेभ्यः MNA-उपचारित-टी-कोशिका-संस्कृतेभ्यः सुपरनेटेन्ट्-इत्यस्य एन्जाइम-लिङ्क्ड् इम्यूनोसोर्बेण्ट्-परीक्षणेन (ELISA) TNFα-मध्ये महती वृद्धिः, IFN-γ-मध्ये न्यूनता, IL-2-मध्ये च कोऽपि परिवर्तनः न दृश्यते (चित्रम् ४, E तः G) . IFN-γ इत्यस्य न्यूनता सूचयति यत् MNA टी कोशिकानां अर्बुदविरोधी क्रियाकलापं निवारयितुं भूमिकां निर्वहति । टी कोशिका-मध्यस्थतायुक्ते कोशिकाविषाक्ततायां MNA इत्यस्य प्रभावस्य अनुकरणार्थं हरितप्रतिदीप्तिप्रोटीन (GFP) -CAR-T) कोशिकाभिः विनियमितानां फोलेट् रिसेप्टर α तथा CAR-T (GFP) इत्यस्य लक्ष्यं कृत्वा काइमेरिकप्रतिजनग्राहकटी (FRα-CAR-T) कोशिकानां उत्पादनं स्वस्थदातृपरिधीयरक्तस्य एकनाभिककोशिकाभिः (PBMC) क्रियते CAR-T कोशिकानां MNA इत्यस्य उपस्थितौ 24 घण्टाः यावत् संवर्धिताः, ततः 10:1 इत्यस्य प्रभावक-लक्ष्य-अनुपातेन फोलेट् रिसेप्टर α अभिव्यक्तवन्तः मानव-एसके-ओवी-3 अण्डकोष-ट्यूमर-कोशिकाभिः सह सह-संवर्धिताः MNA उपचारस्य परिणामेण FRα-CAR-T कोशिकानां वधक्रियाकलापस्य महती न्यूनता अभवत्, यत् एडेनोसाइनेन उपचारितानां FRα-CAR-T कोशिकानां सदृशम् आसीत् (चित्रम् 4H)
(A) कुल व्यवहार्यकोशिकागणना तथा जनसंख्याद्विगुणीकरणं (PD) प्रत्यक्षतया संस्कृतितः 7. बारग्राफः षट् स्वस्थदातृणां औसत + SEM प्रतिनिधित्वं करोति। न्यूनातिन्यूनं n = 3 स्वतन्त्रप्रयोगेभ्यः आँकडानां प्रतिनिधित्वं करोति । (B to D) CD3/CD28 तथा IL-2 इत्येतयोः उपयोगः 7 दिवसपर्यन्तं स्वस्व MNA सान्द्रतायां T कोशिकानां सक्रियीकरणाय कृतः । विश्लेषणात् पूर्वं कोशिकानां PMA/ionomycin इत्यनेन GolgiStop इत्यनेन सह 4 घण्टाः यावत् उत्तेजिताः आसन्। T कोशिकासु TNFα (B) अभिव्यक्तिः। जीवितकोशिकासु TNFα अभिव्यक्तिः उदाहरणप्रतिबिम्बं (वामभागे) तथा सारणीबद्धदत्तांशः (दक्षिणम्)। टी कोशिकासु IFN-γ (C) तथा IL-2 (D) अभिव्यक्तिः। साइटोकाइन्स् इत्यस्य अभिव्यक्तिः प्रवाहकोशिकामापनेन मापिता । बारग्राफः औसतं (n = 6 स्वस्थदातारः) + SEM दर्शयति । P मूल्यं निर्धारयितुं विचरणस्य एकदिशा विश्लेषणं पुनरावृत्तिमापं च (*P<0.05 तथा **P<0.01) उपयुज्यताम् । न्यूनातिन्यूनं n = 3 स्वतन्त्रप्रयोगेभ्यः आँकडानां प्रतिनिधित्वं करोति । (E to G) CD3/CD28 तथा IL-2 इत्येतयोः उपयोगः 7 दिवसपर्यन्तं स्वस्व MNA सान्द्रतायां T कोशिकानां सक्रियीकरणाय कृतः । पीएमए/आयनोमाइसिन-उत्तेजनस्य ४ घण्टाभ्यः पूर्वं पश्चात् च माध्यमं एकत्रितम् । TNFα (E), IFN-γ (F) तथा IL-2 (G) इत्येतयोः सान्द्रता ELISA द्वारा मापिता । बारग्राफः औसतं (n = 5 स्वस्थदातारः) + SEM दर्शयति । विचरणस्य एकदिशाविश्लेषणस्य पुनरावृत्तिमापनस्य च उपयोगेन निर्धारितं P मूल्यं (*P<0.05) । बिन्दुरेखा अन्वेषणस्य अन्वेषणसीमाम् सूचयति । (H) कोशिका विच्छेदन परख। FRα-CAR-T अथवा GFP-CAR-T कोशिकानां एडेनोसाइने (250μM) अथवा MNA (10 mM) इत्यनेन 24 घण्टापर्यन्तं समायोजितं, अथवा अउपचारितं (Ctrl) त्यक्तम्। SK-OV-3 कोशिकानां प्रतिशतं वधं मापितम् । वेल्च टी परीक्षणेन (* P<0.5 तथा **P<0.01) निर्धारितं P मूल्यम्।
MNA-निर्भर-TNFα अभिव्यक्ति-विनियमनस्य यंत्रवत्-अवगमनं प्राप्तुं MNA-उपचारित-टी-कोशिकानां TNFα mRNA-मध्ये परिवर्तनस्य मूल्याङ्कनं कृतम् (चित्रम् 5A) MNA इत्यनेन उपचारितानां स्वस्थदातृ-टी-कोशिकानां TNFα-प्रतिलेखनस्तरस्य द्विगुणं वृद्धिः दृश्यते, यत् सूचयति यत् MNA TNFα-प्रतिलेखन-विनियमनस्य उपरि निर्भरः अस्ति अस्य सम्भाव्यस्य नियामकतन्त्रस्य अन्वेषणार्थं, द्वौ ज्ञातौ प्रतिलेखनकारकौ ये TNFα नियन्त्रयन्ति, यथा सक्रियः टी कोशिका नाभिकीयकारकः (NFAT) तथा विशिष्टप्रोटीन 1 (Sp1), समीपस्थ TNFα प्रवर्तकस्य MNA बन्धनस्य प्रतिक्रियारूपेण मूल्याङ्कनं कृतम् ( 30 ). TNFα प्रवर्तकस्य 6 चिह्नितानि NFAT बन्धनस्थलानि 2 Sp1 बन्धनस्थलानि च सन्ति, ये एकस्मिन् स्थले [5'cap तः -55 आधारयुग्मानि (bp)] (30) अतिव्याप्ताः भवन्ति क्रोमैटिन् इम्युनोप्रेसिपिटेशन (ChIP) इत्यनेन ज्ञातं यत् MNA इत्यनेन उपचारे Sp1 इत्यस्य TNFα प्रवर्तकेन ​​सह बन्धनं त्रिगुणं वर्धते । एनएफएटी इत्यस्य समावेशः अपि वर्धितः, महत्त्वं च समीपं गतः (चित्रम् ५ ख) । एते आँकडा: सूचयन्ति यत् MNA Sp1 प्रतिलेखनस्य माध्यमेन TNFα इत्यस्य अभिव्यक्तिं नियन्त्रयति, न्यूनतया च NFAT इत्यस्य अभिव्यक्तिं नियन्त्रयति ।
(A) MNA विना संवर्धितानां T कोशिकानां तुलने MNA इत्यनेन उपचारित T कोशिकासु TNFα अभिव्यक्तिस्य गुना परिवर्तनम्। SEM सह अभिव्यक्तिप्रतिमानं दर्शितं (n = 5 स्वस्थदातारः)। न्यूनातिन्यूनं n = 3 स्वतन्त्रप्रयोगेभ्यः आँकडानां प्रतिनिधित्वं करोति । (B) NFAT तथा Sp1 इत्यस्य अनन्तरं 8 mM MNA इत्यनेन सह वा विना वा उपचारितानां T कोशिकानां TNFα प्रवर्तकं (Ctrl) तथा PMA/ionomycin उत्तेजनेन सह 4 घण्टां यावत् संयोजितम्। इम्यूनोग्लोबुलिन् जी (IgG) तथा एच् ३ इत्येतयोः उपयोगः क्रमशः इम्यूनोप्रेसिपिटेशनस्य कृते नकारात्मकं सकारात्मकं च नियन्त्रणरूपेण कृतः । ChIP इत्यस्य परिमाणनिर्धारणेन ज्ञातं यत् MNA-उपचारितकोशिकासु TNFα प्रवर्तकेन ​​सह Sp1 तथा NFAT इत्येतयोः बन्धनं नियन्त्रणस्य तुलने अनेकवारं वर्धितम्। न्यूनातिन्यूनं n = 3 स्वतन्त्रप्रयोगेभ्यः आँकडानां प्रतिनिधित्वं करोति । बहुभिः t-परीक्षाभिः (*** P <0.01) निर्धारितं P मूल्यम् । (C) एचजीएससी इत्यस्य जलोदरस्य तुलने टी कोशिका (गैर-साइटोटोक्सिक) अर्बुरे TNF इत्यस्य अभिव्यक्तिं वर्धितवती । वर्णाः भिन्न-भिन्न-रोगिणां प्रतिनिधित्वं कुर्वन्ति । प्रदर्शितकोशिकानां यादृच्छिकरूपेण 300 यावत् नमूनाकरणं कृतम् अस्ति तथा च अतिकर्षणं सीमितं कर्तुं जिटर कृतम् अस्ति (** Padj = 0.0076) । (D) अण्डकोषकर्क्कटस्य कृते MNA इत्यस्य प्रस्तावितं प्रतिरूपम्। एमएनए टीएमई इत्यस्मिन् ट्यूमरकोशिकासु, रेशेःकोशिकासु च उत्पाद्यते, टी कोशिकाभिः च गृह्यते । MNA Sp1 इत्यस्य TNFα प्रवर्तकेन ​​सह बन्धनं वर्धयति, येन TNFα प्रतिलेखनं, TNFα साइटोकाइन् उत्पादनं च वर्धते । MNA इत्यनेन IFN-γ इत्यस्य न्यूनता अपि भवति । टी कोशिकानां कार्यस्य निरोधेन वधक्षमता न्यूनीभवति, अर्बुदस्य वृद्धिः च त्वरिता भवति ।
रिपोर्ट्-अनुसारं TNFα इत्यस्य अग्रे पृष्ठे च निर्भराः अर्बुदविरोधी अर्बुदविरोधी च प्रभावाः सन्ति, परन्तु अण्डकोषकर्क्कटस्य वृद्धिं मेटास्टेसिसं च प्रवर्धयितुं तस्य सुप्रसिद्धा भूमिका अस्ति (31-33) रिपोर्ट्-अनुसारं अण्डकोषकर्क्कटरोगिषु जलोदरेषु, ट्यूमर-उतकेषु च TNFα-सान्द्रता सौम्य-उपस्थेषु अपेक्षया अधिका भवति (३४-३६) तन्त्रस्य दृष्ट्या TNFα श्वेतरक्तकोशिकानां सक्रियीकरणं, कार्यं, प्रसारं च नियन्त्रयितुं शक्नोति, तथा च कर्करोगकोशिकानां फेनोटाइपं परिवर्तयितुं शक्नोति (37, 38) एतेषां निष्कर्षाणां अनुरूपं, विभेदकजीनव्यञ्जनविश्लेषणेन ज्ञातं यत् जलोदरस्य तुलने ट्यूमर ऊतकयोः टीकोशिकासु TNF महत्त्वपूर्णतया अप-रेगुलेटः आसीत् (चित्रम् 5C)। TNF अभिव्यक्तिः वृद्धिः केवलं गैर-साइटोटोक्सिक फेनोटाइपयुक्तेषु T कोशिकाजनसंख्यासु एव स्पष्टा आसीत् (चित्रम् S5A) । सारांशेन एते आँकडा: एतस्य मतस्य समर्थनं कुर्वन्ति यत् एचजीएससी-मध्ये एमएनए-इत्यस्य द्वय-प्रतिरक्षादमनकारी-ट्यूमर-प्रवर्धक-प्रभावाः सन्ति ।
प्रवाहकोशिकामापनस्य आधारेण प्रतिदीप्तलेबलिंग् टीआईएल चयापचयस्य अध्ययनस्य मुख्या पद्धतिः अभवत् । एतेषु अध्ययनेषु ज्ञातं यत् गौणलिम्फोइड-अङ्गानाम् परिधीय-रक्त-लिम्फोसाइट्स् अथवा टी-कोशिकानां तुलने मूषकाणां मानवस्य च TIL-इत्यस्य ग्लूकोजस्य ग्रहणस्य प्रवृत्तिः अधिका भवति (4, 39) तथा च माइटोकॉन्ड्रिया-कार्यस्य क्रमिकहानिः भवति (19, 40) यद्यपि अस्मिन् अध्ययने अस्माभिः समानानि परिणामानि अवलोकितानि, तथापि मुख्यविकासः एकस्मात् एव विच्छेदित-अर्बुद-उतकात् ट्यूमर-कोशिकानां, TIL-इत्यस्य च चयापचयस्य तुलना करणीयम् एतेषु केषुचित् पूर्वप्रतिवेदनेषु सङ्गतम्, जलोदरात् ट्यूमरतः (CD45-EpCAM +) कोशिकासु CD8 + तथा CD4 + T कोशिकानां अपेक्षया अधिकं ग्लूकोजस्य अवशोषणं भवति, यत् समर्थयति यत् ट्यूमरकोशिकानां उच्चग्लूकोजस्य अवशोषणस्य तुलना T कोशिकाभिः सह कर्तुं शक्यते टी कोशिका स्पर्धायाः अवधारणा। TME. परन्तु ट्यूमरकोशिकानां माइटोकॉन्ड्रियाक्रियाशीलता CD8 + T कोशिकानां अपेक्षया अधिका भवति, परन्तु माइटोकॉन्ड्रियाक्रियाशीलता CD4 + T कोशिकानां सदृशी भवति एते परिणामाः उदयमानं विषयं पुष्टयन्ति यत् आक्सीडेटिव चयापचयः ट्यूमरकोशिकानां कृते महत्त्वपूर्णः अस्ति (41, 42) । ते इदमपि सूचयन्ति यत् CD4 + T कोशिकानां CD4 + T कोशिकानां अपेक्षया आक्सीडेटिव विकारस्य अधिकं प्रवणाः भवितुम् अर्हन्ति, अथवा CD4 + T कोशिका माइटोकॉन्ड्रियाक्रियाकलापं निर्वाहयितुम् ग्लूकोजात् परं कार्बनस्रोतानां उपयोगं कर्तुं शक्नुवन्ति (43, 44) ज्ञातव्यं यत् अस्माभिः जलोदरेषु CD4 + T प्रभावकाणां, T प्रभावकस्मृतेः, T केन्द्रीयस्मृतिकोशिकानां च मध्ये ग्लूकोजस्य अवशोषणे वा माइटोकॉन्ड्रियाक्रियाकलापस्य वा कोऽपि अन्तरः न अवलोकितः। तथैव ट्यूमरमध्ये CD8 + T कोशिकानां भेदभावस्थितेः ग्लूकोजस्य अवशोषणस्य परिवर्तनेन सह किमपि सम्बन्धः नास्ति, येन विट्रो-संवर्धितानां टी-कोशिकानां तथा विवो-मध्ये मानव-TIL-इत्यस्य च महत्त्वपूर्णं अन्तरं प्रकाशितं भवति (22) एतेषां अवलोकनानाम् पुष्टिः निष्पक्षस्वचालितकोशिकाजनसंख्याविनियोगस्य उपयोगेन अपि अभवत्, येन अग्रे ज्ञातं यत् ट्यूमरकोशिकानां अपेक्षया अधिकं ग्लूकोज-उपग्रहणं माइटोकॉन्ड्रिया-क्रियाकलापं च युक्ताः CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + कोशिकाः प्रचलिताः सन्ति परन्तु मेटाबोलिक सक्रियकोशिकाजनसंख्या अस्ति इयं जनसंख्या scRNA-seq विश्लेषणे चिह्नितानां मायलोइड् सप्रेसरकोशिकानां अथवा प्लाज्मासाइटोइड् डेण्ड्रिटिक कोशिकानां कथित उपजनसंख्यायाः प्रतिनिधित्वं कर्तुं शक्नोति । यद्यपि एतयोः द्वयोः अपि मानवस्य अण्डकोषस्य अर्बुदेषु [४५] ज्ञातम्, तथापि तेषां आवश्यकता अस्ति Further work is to describe this myeloid subpopulation.
यद्यपि प्रवाहकोशिकामापन-आधारित-विधयः कोशिका-प्रकारस्य मध्ये ग्लूकोजस्य आक्सीडेटिव-चयापचयस्य च सामान्य-अन्तराणि स्पष्टीकर्तुं शक्नुवन्ति तथापि टीएमई-मध्ये माइटोकॉन्ड्रिया-चयापचयस्य कृते ग्लूकोज-अथवा कार्बन-स्रोतैः उत्पादिताः सटीक-चयापचय-द्रव्याणि अद्यापि न निर्धारितानि सन्ति कस्मिंश्चित् TIL उपसमूहे चयापचयद्रव्याणां उपस्थितिः अभावः वा नियुक्तुं निष्कासित ऊतकात् कोशिकाजनसंख्यायाः शुद्धिः आवश्यकी भवति । अतः अस्माकं कोशिकासंवर्धनपद्धतिः द्रव्यमानवर्णक्रममापनेन सह संयुक्ता चयापचयद्रव्याणां विषये अन्वेषणं प्रदातुं शक्नोति ये टी कोशिकासु तथा च ट्यूमरकोशिकाजनसंख्यासु मेलने रोगी नमूनासु भिन्नरूपेण समृद्धाः भवन्ति। यद्यपि अस्याः पद्धत्याः प्रतिदीप्ति-सक्रिय-कोशिका-क्रमणस्य अपेक्षया लाभाः सन्ति, तथापि निहित-स्थिरतायाः तथा/वा द्रुत-परिवर्तन-दरस्य कारणेन कतिपय-चयापचय-पुस्तकालयाः प्रभाविताः भवितुम् अर्हन्ति (22) तथापि अस्माकं पद्धतिः एडेनोसाइन्, क्युरेनिन् इति द्वौ मान्यताप्राप्तौ प्रतिरक्षादमनकचयापचयद्रव्यौ चिन्तयितुं समर्था अभवत्, यतः ते नमूनाप्रकारयोः मध्ये बहु भिन्नाः सन्ति
ट्यूमरस्य TIL उपप्रकारस्य च अस्माकं चयापचयविश्लेषणं अण्डकोषस्य TME इत्यस्मिन् चयापचयद्रव्यस्य भूमिकायाः ​​विषये अधिकान् अन्वेषणं प्रदाति। प्रथमं प्रवाहकोशिकामापनस्य उपयोगेन वयं निर्धारितवन्तः यत् अर्बुदानां CD4 + T कोशिकानां च मध्ये माइटोकॉन्ड्रियाक्रियाकलापस्य कोऽपि अन्तरः नास्ति । परन्तु LC-MS/MS विश्लेषणेन एतेषु जनसंख्यासु चयापचयद्रव्याणां प्रचुरतायां महत्त्वपूर्णपरिवर्तनं ज्ञातम्, यत् सूचयति यत् TIL चयापचयस्य विषये निष्कर्षाणां तस्य समग्रचयापचयक्रियाकलापस्य च सावधानीपूर्वकं व्याख्यायाः आवश्यकता वर्तते। द्वितीयं, MNA इति चयापचयद्रव्यं यस्य CD45-कोशिकानां T कोशिकानां च मध्ये सर्वाधिकं अन्तरं भवति, न तु अर्बुदेषु । अतः विभागीकरणस्य ट्यूमरस्थानस्य च TIL चयापचयस्य उपरि भिन्नाः प्रभावाः भवितुम् अर्हन्ति, यत् दत्तसूक्ष्मवातावरणे सम्भाव्यविषमताम् प्रकाशयति तृतीयम्, एमएनए-उत्पादक-एन्जाइमस्य एनएनएमटी-अभिव्यक्तिः मुख्यतया सीएएफ-पर्यन्तं सीमितं भवति, यत् न्यूनतया ट्यूमर-कोशिका अस्ति, परन्तु ट्यूमर-व्युत्पन्न-टी-कोशिकासु ज्ञातुं शक्याः एमएनए-स्तराः अवलोकिताः भवन्ति अण्डकोषस्य CAF इत्यस्मिन् NNMT इत्यस्य अतिअभिव्यक्तेः ज्ञातः कैंसर-प्रवर्धकः प्रभावः भवति, यस्य कारणं CAF चयापचयस्य, ट्यूमर-आक्रमणस्य, मेटास्टेसिसस्य च प्रवर्धनस्य कारणम् अस्ति (27) यद्यपि TIL इत्यस्य समग्रस्तरः मध्यमः अस्ति तथापि CAF इत्यस्मिन् NNMT इत्यस्य अभिव्यक्तिः कैंसर जीनोम एटलस् (TCGA) मेसेन्काइमल उपप्रकारेन सह निकटतया सम्बद्धा अस्ति, यत् दुर्बलपूर्वसूचनायाः सह सम्बद्धम् अस्ति (27, 46, 47) अन्ते एमएनए-क्षयस्य उत्तरदायी एन्जाइमस्य एओएक्स१ इत्यस्य अभिव्यक्तिः अपि सीएएफ-जनसंख्यायां सीमितं भवति, यत् सूचयति यत् टी-कोशिकासु एमएनए-चयापचयस्य क्षमतायाः अभावः अस्ति एते परिणामाः अस्य विचारस्य समर्थनं कुर्वन्ति यत् यद्यपि अस्य निष्कर्षस्य सत्यापनार्थं अग्रे कार्यस्य आवश्यकता वर्तते तथापि टी कोशिकासु MNA इत्यस्य उच्चस्तरः प्रतिरक्षादमनकारी CAF सूक्ष्मवातावरणस्य उपस्थितिं सूचयितुं शक्नोति
एमएनए परिवहनकर्तृणां न्यूनव्यञ्जनस्तरं दृष्ट्वा तथा च एमएनए चयापचयस्य प्रमुखप्रोटीनानां अज्ञातस्तरं दृष्ट्वा टी कोशिकासु एमएनए इत्यस्य उपस्थितिः अप्रत्याशितरूपेण भवति न तु NNMT न AOX1 scRNA-seq विश्लेषणेन तथा च द्वयोः स्वतन्त्रसमूहयोः लक्षित qPCR द्वारा ज्ञापयितुं शक्यते स्म । एते परिणामाः सूचयन्ति यत् एमएनए टी कोशिकाभिः संश्लेषितं न भवति, अपितु परितः टीएमई इत्यस्मात् अवशोषितं भवति । इन् विट्रो प्रयोगेषु ज्ञायते यत् टी कोशिका बहिर्जातीयम् एमएनए-सञ्चयं कर्तुं प्रवृत्ताः भवन्ति ।
अस्माकं इन विट्रो अध्ययनेन ज्ञातं यत् बहिर्जातीयः MNA T कोशिकासु TNFα इत्यस्य अभिव्यक्तिं प्रेरयति तथा च Sp1 इत्यस्य TNFα प्रवर्तकेन ​​सह बन्धनं वर्धयति। यद्यपि TNFα इत्यस्य अर्बुदविरोधी अर्बुदविरोधी च कार्याणि सन्ति तथापि अण्डकोषकर्क्कटस्य मध्ये TNFα अण्डकोषकर्क्कटस्य वृद्धिं प्रवर्धयितुं शक्नोति (३१-३३) । अण्डकोषस्य ट्यूमरकोशिकासंस्कृतौ TNFα इत्यस्य बेअसरीकरणं अथवा माउसमाडलमध्ये TNFα संकेतस्य उन्मूलनं TNFα-मध्यस्थतायुक्तं भड़काऊ साइटोकाइन् उत्पादनं सुधारयितुं शक्नोति तथा च ट्यूमरवृद्धिं निरुद्धं कर्तुं शक्नोति ( 32 , 35 ). अतः, अस्मिन् सन्दर्भे, TME-व्युत्पन्नः MNA ऑटोक्राइन-पाशस्य माध्यमेन TNFα-निर्भर-तन्त्रस्य माध्यमेन प्रो-इन्फ्लेमेटरी मेटाबोलाइट् इत्यस्य रूपेण कार्यं कर्तुं शक्नोति, तस्मात् अण्डकोष-कर्क्कटस्य घटनां प्रसारं च प्रवर्धयति (31) एतस्याः सम्भावनायाः आधारेण अण्डकोषकर्क्कटस्य सम्भाव्यचिकित्साकारकरूपेण TNFα नाकाबन्दी अध्ययनं क्रियते (37, 48, 49) । तदतिरिक्तं, MNA अण्डकोषस्य ट्यूमरकोशिकानां कृते CAR-T कोशिकानां कोशिकाविषाक्ततां बाधते, येन MNA-मध्यस्थप्रतिरक्षादमनस्य अधिकं प्रमाणं प्राप्यते । सामूहिकरूपेण एते परिणामाः एकं प्रतिरूपं सूचयन्ति यस्मिन् ट्यूमरः CAF कोशिका च बाह्यकोशिकीय TME मध्ये MNA स्रावयन्ति । (i) TNF-प्रेरितस्य अण्डकोषकर्क्कटवृद्धेः उत्तेजनस्य तथा (ii) MNA-प्रेरितस्य T कोशिका कोशिकाविषाक्तक्रियाकलापनिरोधस्य माध्यमेन अस्य द्वयात्मकः ट्यूमरप्रभावः भवितुम् अर्हति (चित्रम् 5D)
निष्कर्षतः, द्रुतकोशिकासंवर्धनस्य, एककोशिकीय-अनुक्रमणस्य, चयापचय-प्रोफाइलिंगस्य च संयोजनं प्रयोज्य, अस्मिन् अध्ययने एचजीएससी-रोगिषु ट्यूमर-जलोर-कोशिकानां मध्ये विशालः इम्यूनोमेटाबोलोमिक-अन्तरः प्रकाशितः अस्मिन् व्यापकविश्लेषणेन ज्ञातं यत् टी-कोशिकानां मध्ये ग्लूकोज-ग्रहणे माइटोकॉन्ड्रिया-क्रियाकलापस्य च भेदाः सन्ति, तथा च एमएनए-इत्यस्य अकोशिका-स्वायत्त-प्रतिरक्षा-नियामक-चयापचयस्य रूपेण पहिचानः कृतः एतेषां आँकड़ानाम् प्रभावः अस्ति यत् मानवकर्क्कटेषु TME टी कोशिका चयापचयं कथं प्रभावितं करोति। यद्यपि टी कोशिकानां कर्करोगकोशिकानां च मध्ये पोषकद्रव्याणां प्रत्यक्षस्पर्धा ज्ञाता अस्ति तथापि चयापचयद्रव्याणि ट्यूमरस्य प्रगतिम् प्रवर्तयितुं सम्भवतः अन्तःजातप्रतिरक्षाप्रतिक्रियाः दमनार्थं च अप्रत्यक्षनियामकरूपेण अपि कार्यं कर्तुं शक्नुवन्ति एतेषां नियामकचयापचयद्रव्याणां कार्यात्मकभूमिकायाः ​​अग्रे वर्णनं अर्बुदविरोधी प्रतिरक्षाप्रतिक्रियावर्धनार्थं वैकल्पिकरणनीतयः उद्घाटयितुं शक्नोति
कनाडा ऊतकभण्डारजालद्वारा प्रमाणितस्य बीसी कैंसर ट्यूमर ऊतक भण्डारस्य माध्यमेन रोगी नमूनानि नैदानिकदत्तांशं च प्राप्तम्। बीसी कैंसर रिसर्च एथिक्स कमेटी तथा ब्रिटिश कोलम्बिया विश्वविद्यालयेन (H07-00463) अनुमोदितस्य प्रोटोकॉलस्य अनुसारं सर्वेषां रोगिणां नमूनानां नैदानिकदत्तांशस्य च सूचितलिखितसहमतिः प्राप्ता अथवा औपचारिकरूपेण तेषां सहमतिः माफीकृता। नमूनानि प्रमाणितबायोबैङ्के (BRC-00290) संगृह्यन्ते । विस्तृतरूपेण रोगी लक्षणं सारणी S1 तथा S5 मध्ये दर्शितम् अस्ति। क्रायो-संरक्षणार्थं रोगीनां अर्बुद-नमूनायाः यंत्रवत् विघटनार्थं स्केलपेल्-इत्यस्य उपयोगः भवति ततः १००-माइक्रोन-छिद्रकेण धक्कायित्वा एककोशिकनिलम्बनं प्राप्तुं शक्यते रोगी जलोदरं 1500 आरपीएम मध्ये 4°C मध्ये 10 निमेषान् यावत् अपकेन्द्रीकृत्य कोशिकानां गोलीं कृत्वा उपरितनं निष्कासितम्। ट्यूमर-जलोदरात् प्राप्तानि कोशिकानि ५०% ताप-निष्क्रिय-मानव-एबी-सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच्), ४०% आरपीएमआई-१६४० (थर्मो फिशर साइंटिफिक) तथा १०% डाइमिथाइल-सल्फोक्साइड् इत्यत्र क्रायो-संरक्षितानि आसन् एतेषां संरक्षितानां एककोशिकीयनिलम्बनानां पिघलनं कृत्वा अधोवर्णितस्य चयापचयविज्ञानस्य चयापचयनिर्धारणाय च उपयोगः कृतः ।
सम्पूर्णमाध्यमे 0.22 μm फ़िल्टर 50:50 पूरक RPMI 1640: AimV भवति । आरपीएमआई 1640 + 2.05 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) 10% ताप-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 12.5 एमएम हेपेस् (थर्मो फिशर साइंटिफिक), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) फिशर साइंटिफिक), 1 x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (PenStrep) घोल (Thermo Fisher Scientific) तथा 50 μMB-मर्कैप्टोइथेनॉल। AimV (Invitrogen) इत्यस्य पूरकं २० mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) तथा 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) इत्यनेन भवति । प्रवाहकोशिकामापकस्य धुंधलापनबफरस्य 0.22μm छानितं फॉस्फेटबफरयुक्तं खारा (PBS; Invitrogen) 3% ताप-निष्क्रिय-एबी मानवसीरम (Sigma) इत्यनेन पूरितम् आसीत् कोशिकासंवर्धनबफरः 0.22μm फ़िल्टर PBS इत्यनेन निर्मितः भवति तथा च 0.5% ताप-निष्क्रियः मानव एबी सीरम (Sigma-Aldrich) इत्यनेन पूरितः भवति ।
३७°C पूर्णमाध्यमे कोशिकानां १० nM MT DR तथा 100 μM 2-NBDG इत्यनेन ३० निमेषपर्यन्तं रङ्गणं कृतम् । तदनन्तरं कोशिकानां जीवनक्षमता रञ्जकेन eF506 इत्यनेन ४ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं १५ निमेषपर्यन्तं रञ्जनं कृतम् । कोशिकानां FC Block (eBioscience) तथा Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) इत्येतयोः पुनः निलम्बनं कृत्वा, flow cytometer staining buffer इत्यस्मिन् पतला कृत्वा (निर्मातुः निर्देशानुसारं), कक्षस्य तापमाने 10 निमेषपर्यन्तं इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु। कोशिकानां प्रतिपिण्डानां समुच्चयेन (सारणी S2) प्रवाहकोशिकामापन-रञ्जनबफरमध्ये 4°C 20 निमेषपर्यन्तं दागं कुर्वन्तु। विश्लेषणात् पूर्वं प्रवाहकोशिकामिति धुंधलाबफर (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R विन्यास) इत्यस्मिन् कोशिकानां पुनः निलम्बनं कुर्वन्तु। सेलगणनादत्तांशस्य विश्लेषणार्थं SpectroFlo तथा FlowJo V10 इत्येतयोः उपयोगं कुर्वन्तु, तथा च आँकडानां निर्माणार्थं GraphPad Prism 8 इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । 2-NBDG तथा MT DR इत्येतयोः मध्यमप्रतिदीप्तितीव्रता (MFI) log-normalized कृतम्, ततः मिलानरोगिणां लेखानुरूपं सांख्यिकीयविश्लेषणार्थं युग्मित t परीक्षणस्य उपयोगः कृतः विश्लेषणात् ४० तः न्यूनानि घटनानि युक्तानि सर्वाणि जनसंख्यानि निष्कासयन्तु; सांख्यिकीयविश्लेषणं तथा आँकडादृश्यीकरणं कर्तुं पूर्वं कस्यापि नकारात्मकमूल्यानां कृते 1 इत्यस्य MFI मूल्यं प्रविष्टं कुर्वन्तु।
उपर्युक्तप्रक्रियापटलस्य मैनुअल् गेटिंग् रणनीत्याः पूरकत्वेन वयं FlowJo इत्यस्मिन् मृतकोशिकानां समाप्तेः अनन्तरं जनसंख्यायां स्वयमेव कोशिकानां नियुक्त्यर्थं आकारप्रतिबन्धवृक्षेन (FAUST) (21) पूर्णटिप्पण्याः उपयोगं कृतवन्तः वयं मैन्युअल् रूपेण आउटपुट् प्रबन्धयामः येषां जनसंख्यानां विलीनीकरणं भवति (PD1+ इत्यस्य PD1-ट्यूमरकोशिकानां सह संयोजनं) तथा च अवशिष्टानां जनसंख्यानां विलयः। प्रत्येकं नमूने औसतेन २% अधिकानि कोशिकानि सन्ति, कुलम् ११ जनसंख्यानां कृते ।
ल्यूकोसाइट् पृथक्करण उत्पादात् (STEMCELL Technologies) पीबीएमसी पृथक् कर्तुं फिकोल् ढाल घनत्व अपकेन्द्रीकरणस्य उपयोगः कृतः । CD8 + T कोशिकानां CD8 MicroBeads (Miltenyi) इत्यस्य उपयोगेन PBMC तः पृथक् कृत्वा निर्मातुः निर्देशानुसारं TransAct (Miltenyi) इत्यस्य उपयोगेन 2 सप्ताहपर्यन्तं पूर्णमाध्यमे विस्तारः कृतः कोशिकानां IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) युक्ते सम्पूर्णे माध्यमे 5 दिवसान् यावत् स्थातुं शक्यते स्म, ततः TransAct इत्यनेन पुनः उत्तेजितं कृतम् । ७ दिनाङ्के निर्मातुः निर्देशानुसारं मानवस्य CD45 MicroBeads (Miltenyi) इत्यस्य उपयोगः कोशिकानां समृद्ध्यर्थं क्रमशः त्रीणि गोलानि कृता कोशिकानां प्रवाहकोशिकामापनविश्लेषणार्थं (यथा उपरि वर्णितं) विभक्तं कृतम्, LC-MS/MS विश्लेषणार्थं च दशलाखकोशिकानां त्रिवारं विच्छेदनं कृतम् नमूनानि LC-MS/MS द्वारा अधोवर्णितरीत्या संसाधितानि आसन् । वयं १,००० आयनसङ्ख्यायाः सह लुप्तचयापचयमूल्यं अनुमानितवन्तः । प्रत्येकं नमूना कुल आयनसंख्या (TIC) द्वारा सामान्यीकृतं भवति, लघुगणकीयरूपेण परिवर्तितं भवति तथा च विश्लेषणात् पूर्वं MetaboAnalystR मध्ये स्वयमेव सामान्यीकृतं भवति।
प्रत्येकस्य रोगी एककोशिकानिलम्बनं पिघल्य 40 μm छाननेन पूर्णमाध्यमे (यथा उपरि वर्णितं) छानितम्। निर्मातुः प्रोटोकॉलस्य अनुसारं CD8+, CD4+ तथा CD45- कोशिकानां (हिमस्य उपरि) नमूनानां समृद्ध्यर्थं MicroBeads (Miltenyi) इत्यस्य उपयोगेन चुम्बकीयमणिपृथक्करणेन सकारात्मकचयनस्य त्रीणि क्रमिकपरिक्रमणानि उपयुज्यन्ते स्म संक्षेपेण कोशिकानां कोशिकासंवर्धनबफरमध्ये (यथा उपरि वर्णितं) पुनः लम्बितानि भवन्ति, गण्यन्ते च । कोशिकानां मानवसीडी८ मणिभिः, मानवसीडी४ मणिभिः वा मानवसीडी४५ मणिभिः (Miltenyi) ४°C मध्ये १५ निमेषपर्यन्तं इन्क्यूबेशनं कृतम्, ततः कोशिकासंवर्धनबफरेन प्रक्षालितम् नमूना LS स्तम्भेन (Miltenyi) पारितं भवति, सकारात्मकं नकारात्मकं च अंशं संग्रह्यते । अवधिं न्यूनीकर्तुं कोशिकापुनर्प्राप्तिपदं अधिकतमं कर्तुं च ततः CD4+-संवर्धनस्य द्वितीयपरिक्रमाय CD4-अंशस्य उपयोगः भवति, तदनन्तरं CD45-समृद्ध्यर्थं च CD4-अंशस्य उपयोगः भवति सम्पूर्णे पृथक्करणप्रक्रियायां समाधानं हिमे स्थापयन्तु।
चयापचयविश्लेषणार्थं नमूनानि सज्जीकर्तुं कोशिकानां एकवारं हिमशीतलवणविलयनेन प्रक्षालितं, प्रत्येकस्मिन् नमूने १ मिलीलीटरं ८०% मेथनॉलं योजितं, ततः भंवरं कृत्वा द्रवनाइट्रोजनमध्ये स्नैप जमेन कृतम् नमूनानां त्रयः फ्रीज-थॉ चक्रं कृत्वा 14,000 आरपीएम इत्यत्र 15 निमेषपर्यन्तं 4°C इत्यत्र अपकेन्द्रीकरणं कृतम् । चयापचयद्रव्याणि युक्तं उपरितनं शुष्कं यावत् वाष्पीकरणं भवति । चयापचयद्रव्याणि 0.03% फॉर्मिक अम्लस्य 50 μl मध्ये पुनः विलीनीकृत्य, मिश्रणार्थं भंवरं कृत्वा, ततः मलिनमवशेषं दूरीकर्तुं अपकेन्द्रीकरणं कृतम् ।
पूर्वोक्तरीत्या चयापचयद्रव्याणि निष्कासयन्तु। मेटाबोलोमिक्स-संशोधनार्थं उच्च-प्रदर्शन-द्रव-क्रोमैटोग्राफी-बोतलेषु सुपरनेटान्ट्-इत्येतत् स्थानान्तरयन्तु । बैच-प्रभावं निवारयितुं प्रत्येकं नमूनायाः समानसङ्ख्यायाः कोशिकाभिः उपचारं कर्तुं यादृच्छिक-उपचार-प्रोटोकॉलस्य उपयोगं कुर्वन्तु । अस्माभिः AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) इत्यत्र पूर्वं प्रकाशितस्य वैश्विकचयापचयद्रव्यस्य गुणात्मकं मूल्याङ्कनं कृतम्। MultiQuant संस्करण 2.1 सॉफ्टवेयर (Applied Biosystems SCIEX) इत्यस्य उपयोगेन क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषणं शिखरक्षेत्रस्य एकीकरणं च कृतम् ।
अनुपलब्धचयापचयद्रव्यस्य मूल्यस्य अनुमानार्थं 1000 आयनगणनायाः उपयोगः कृतः, नमूनाप्रक्रियातः साधनविश्लेषणेन प्रवर्तितानां परिवर्तनानां सम्यक्करणाय प्रत्येकस्य ज्ञापितस्य चयापचयद्रव्यस्य सामान्यीकृतशिखरक्षेत्रस्य गणनाय प्रत्येकस्य नमूनायाः TIC इत्यस्य उपयोगः कृतः TIC इत्यस्य सामान्यीकरणस्य अनन्तरं लघुगणकीयरूपान्तरणस्य स्वचालितमान्यरेखास्केलिंगस्य च कृते MetaboAnalystR(51) (पूर्वनिर्धारितपैरामीटर्) इत्यस्य उपयोगः भवति । नमूनाप्रकारस्य मध्ये मेटाबोलोम-अन्तरस्य अन्वेषणात्मकविश्लेषणं कर्तुं वयं शाकाहारी-आर-सङ्कुलेन सह PCA-इत्यस्य उपयोगं कृतवन्तः, तथा च रोगिणां विश्लेषणार्थं आंशिक-अतिरिक्तता-विश्लेषणस्य उपयोगं कृतवन्तः नमूनानां मध्ये यूक्लिडियन-अन्तरं समूहयितुं ताप-नक्शा-डेण्ड्रोग्रामस्य निर्माणार्थं वार्ड-पद्धतेः उपयोगं कुर्वन्तु । वयं सम्पूर्णकोशिकाप्रकारे सूक्ष्मवातावरणे च भिन्नरूपेण प्रचुरचयापचयद्रव्याणां पहिचानाय मानकीकृतचयापचयद्रव्यप्रचुरतायां लिम्मा (52) इत्यस्य उपयोगं कृतवन्तः। व्याख्यां सरलीकर्तुं वयं मॉडलं निर्दिष्टुं समूहमाध्यमापदण्डस्य उपयोगं कुर्मः, तथा च सूक्ष्मवातावरणे कोशिकाप्रकारं प्रत्येकं समूहरूपेण विचारयामः (n = 6 समूहाः) for the significance test, we performed three repeated measurements for each metabolite मिथ्याप्रतिकृतिं परिहरितुं रोगी लिम्मा-डिजाइन-मध्ये बाधकरूपेण समाविष्टः आसीत् विभिन्नरोगिणां मध्ये चयापचयद्रव्येषु भेदस्य जाँचार्थं वयं रोगिणां सहितं लिम्मा-प्रतिरूपं नियतरूपेण समायोजितवन्तः । वयं कोशिकाप्रकारस्य तथा Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction) इत्यस्य सूक्ष्मवातावरणस्य च मध्ये पूर्वनिर्दिष्टविपरीततायाः महत्त्वं प्रतिवेदयामः।
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% व्यवहार्यता) इत्यस्य उपयोगेन ऊर्जासंवर्धनस्य अनन्तरं 10x 5′जीन अभिव्यक्तिप्रोटोकॉलस्य उपयोगेन कुलजीवितजमे जलोदरस्य ट्यूमरस्य च नमूनानां उपरि एककोशिका-ट्रांस्क्रिप्टोम-अनुक्रमणं कृतम् पञ्च अर्बुदानां जलोराणां च सङ्गतिप्रकरणानाम् विश्लेषणं कृतम्, यद्यपि एकस्मात् अर्बुदनमूनात् न्यूना व्यवहार्यता तस्य समावेशं निवारयति स्म । रोगिणां बहुविधचयनं प्राप्तुं वयं 10x क्रोमियमनियन्त्रकस्य लेनेषु प्रत्येकस्य रोगी नमूनानि संयोजितवन्तः, जलोदरस्य, अर्बुदस्य च स्थलानां पृथक् पृथक् विश्लेषणं कृतवन्तः अनुक्रमणानन्तरं [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp युग्मित अन्तः (PE), क्यूबेक जीनोम; क्रमशः ट्यूमरस्य जलनस्य च कृते प्रतिकोशिकायां 73,488 तथा 41,378 रीड्स् इत्यस्य औसतं]], अस्माभिः CellSNP तथा Vireo (53) (CelSNP इत्यस्य आधारेण यथा GRCh38 द्वारा प्रदत्तं सामान्यं मानवीयं SNP (VCF) दातृपरिचयः नियुक्तः भवति इति उपयुज्यते स्म। अनिर्दिष्टकोशिकानां तथा द्वैधरूपेण चिह्नितानां कोशिकानां च बहिष्कारः तथा जलन-ट्यूमर-नमूनानां (54) मध्ये मेलनं कुर्वन्तः अस्य कार्यस्य आधारेण, वयं स्कैटर-(55) तथा स्क्रैन् (56) बायोकण्डक्टर-पैकेजिंग्-मध्ये द्रव्यमान-छनन-पदं कृत्वा, एतेन 6975 कोशिकाः प्राप्ताः (2792 तथा 4183 कोशिकाओं, क्रमशः ट्यूमर तथा जलोदर) विश्लेषण के लिए वयं अभिव्यक्ति द्वारा समूह कोशिकाओं तक Jaccard दूरी के आधार पर igraph के (57) Louvain समूहीकरण का उपयोग कर समूहों को मैन्युअल रूप से कथित कोशिका प्रकारों के लिए मार्कर जीन अभिव्यक्ति द्वारा दृश्यमान किया गया था CD8A तथा GZMA इत्यस्य अभिव्यक्तिद्वारा परिभाषितः, न्यून राइबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्तियुक्तान् उपसमूहान् विहाय वयं Izar et al (16) इत्यस्य प्रकाशितदत्तांशं प्राप्तवन्तः, यत्र तेषां t-SNE एम्बेडिंगः अपि अस्ति, प्रतिरक्षा कोशिका चिह्नानां NNMT अभिव्यक्तिः च मध्ये अभिव्यक्तिः ओवरलैपं नियन्त्रयितुं शक्नोति।
पीबीएमसी इत्येतत् ल्यूकोसाइट् पृथक्करण उत्पादेभ्यः (STEMCELL Technologies) फिकोल् ढालघनत्व अपकेन्द्रीकरणेन पृथक् कृतम् । CD3 + कोशिकानां CD3 मणिबन्धानां (Miltenyi) उपयोगेन PBMC तः पृथक्कृताः । MNA इत्यस्य उपस्थितौ अथवा अभावे CD3+ कोशिकानां प्लेट्-बद्धः CD3 (5μg/ml), घुलनशील CD28 (3μg/ml) तथा IL-2 (300 U/ml; Proleukin) इत्यनेन सक्रियः कृतः विस्तारस्य अन्तिमदिने प्रवाहकोशिकामापनद्वारा व्यवहार्यता (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) तथा प्रसारस्य (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) मूल्याङ्कनं कृतम् GolgiStop इत्यनेन सह PMA (20 ng/ml) तथा ionomycin (1μg/ml) इत्यनेन कोशिकानां उत्तेजनं कृत्वा 4 घण्टापर्यन्तं प्रभावककार्यस्य मूल्याङ्कनं कुर्वन्तु, तथा च CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) तथा TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) इत्यस्य निरीक्षणं कुर्वन्तु। qPCR तथा ChIP कोशिकानां PMA (20 ng/ml) तथा आयनोमाइसिन् (1μg/ml) इत्यनेन 4 घण्टापर्यन्तं उत्तेजयन्तु। ELISA सुपरनेटेंटं PMA (20 ng/ml) तथा आयनोमाइसिन् (1 μg/ml) इत्यनेन 4 घण्टापर्यन्तं उत्तेजनात् पूर्वं पश्चात् च एकत्रितम्।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) इत्यस्य उपयोगेन RNA इत्यस्य पृथक्करणार्थं निर्मातुः प्रोटोकॉलस्य अनुसरणं कुर्वन्तु । नमूनायाः समरूपीकरणाय QIAshredder (QIAGEN) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । पूरक DNA (cDNA) संश्लेषणार्थं उच्चक्षमतायुक्तं RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । जीन अभिव्यक्तिं (निर्मातृणां प्रोटोकॉलस्य अनुसारं) परिमाणं निर्धारयितुं TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ग्लिसरल्डीहाइड-3-फॉस्फेट ऑफ हाइड्रोजन (GAPDH)] तथा Hs01010726_m1 (SLC22A2)। नमूनानि माइक्रोएम्प ऑप्टिकल फिल्मेन सह माइक्रोएम्प फास्ट ऑप्टिकल ९६-वेल् रिएक्शन प्लेट् (एप्लाइड् बायोसिस्टम्स्) इत्यस्मिन् StepOnePlus वास्तविकसमये पीसीआर प्रणाल्या (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) इत्यत्र चालिताः आसन् यत्किमपि Ct मूल्यं ३५ तः अधिकं भवति तत् अन्वेषणदहलीजात् उपरि इति मन्यते, अपरिचययोग्यत्वेन च चिह्नितं भवति ।
पूर्वं यथा वर्णितं तथा चिप् कुर्वन्तु (58)। संक्षेपेण कोशिकानां फॉर्मेल्डीहाइड् (अन्तिमसान्द्रता १.४२%) उपचारः कृत्वा कक्षतापमाने १० निमेषपर्यन्तं इन्क्यूबेशनं कृतम् । 10 निमेषपर्यन्तं हिमस्य उपरि पूरकसूजनबफरस्य (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl तथा 0.1% NP-40) उपयोगं कुर्वन्तु, ततः वर्णितरीत्या प्रतिरक्षावक्षेपबफरमध्ये पुनः निलम्बयन्तु (58 ). ततः नमूना निम्नलिखितचक्रैः सह sonicated अभवत्: 10 चक्राः (20 1-सेकेण्ड् स्पन्दनानि) 40 सेकण्ड् स्थिरसमयः च। ChIP-ग्रेड इम्यूनोग्लोबुलिन् G (कोशिका संकेत प्रौद्योगिकी; 1μl), हिस्टोन H3 (कोशिका संकेत प्रौद्योगिकी; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) तथा SP1 (कोशिका संकेत प्रौद्योगिकी; 3μl) प्रतिपिण्डानि नमूना सह 4°CC शेक इत्यत्र रात्रौ यावत् इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु। प्रोटीन ए मणिः (Thermo Fisher Scientific) नमूना सह ४°C मध्ये १ घण्टापर्यन्तं मन्दं हिलान् इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु, ततः DNA समृद्ध्यर्थं chelex beads (Bio-Rad) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु, प्रोटीनपाचनार्थं proteinase K (Thermo Fisher) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु TNFα प्रवर्तकस्य PCR द्वारा ज्ञायते स्म: अग्रे, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; तस्य विपरीतम्, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp उत्पाद)। इमेज् लैब् (Bio-Rad) द्वारा निर्मिताः इमेजजे सॉफ्टवेयरस्य उपयोगेन परिमाणं च कृतवन्तः ।
कोशिकासंवर्धनस्य उपरि वर्णितरीत्या एकत्रितं कृतम् । निर्धारणं मानव TNFα ELISA किट (Invitrogen), मानव IL-2 ELISA किट (Invitrogen) तथा मानव IFN-γ ELISA किट (Abcam) इत्येतयोः निर्मातुः प्रक्रियानुसारं कृतम् निर्मातुः प्रोटोकॉलस्य अनुसारं TNFα तथा IL-2 इत्येतयोः पत्ताङ्गीकरणाय सुपरनेटेन्ट् १:१००, IFN-γ इत्येतयोः पत्ताङ्गीकरणाय १:३ इति क्षीणीकरणं कृतम् । 450 एनएम इत्यत्र अवशोषणं मापनार्थं EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु ।
पीबीएमसी इत्येतत् ल्यूकोसाइट् पृथक्करण उत्पादेभ्यः (STEMCELL Technologies) फिकोल् ढालघनत्व अपकेन्द्रीकरणेन पृथक् कृतम् । CD3 बीड्स (Miltenyi) इत्यस्य उपयोगेन PBMC इत्यस्मात् CD3 + कोशिकानां पृथक्करणं कृतम् । MNA इत्यस्य उपस्थितौ अथवा अभावे CD3+ कोशिकानां प्लेट्-बद्ध-CD3 (5μg/ml), घुलनशील-CD28 (3μg/ml) तथा IL-2 (300 U/ml; Proleukin) इत्यनेन सह 3 दिवसपर्यन्तं सक्रियीकरणं कृतम् ३ दिवसेभ्यः अनन्तरं कोशिकानां संग्रहणं कृत्वा ०.९% लवणेन प्रक्षालितं, गोली च स्नैप फ्रीज् कृतम् । कोशिकागणना 123count eBeads इत्यस्य उपयोगेन प्रवाहकोशिकामापनेन (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) कृता ।
पूर्वोक्तरीत्या चयापचयद्रव्याणि निष्कासयन्तु। शुष्कसारस्य पुनर्गठनं ४००० कोशिकासमतुल्य/μl सान्द्रतायां कृतम् । उल्टा-चरण क्रोमैटोग्राफी (1290 इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) तथा CORTECS T3 स्तम्भ (2.1×150 मिमी, कण आकार 1.6-μm, छिद्र आकार 120-Å; #186008500, वाटर्स) द्वारा नमूना विश्लेषण करें। ध्रुवीयद्रव्यमानवर्णक्रममापकं (6470, Agilent), यस्मिन् विद्युत्स्प्रे आयनीकरणं सकारात्मकविधाने कार्यं करोति । चलचरणं A 0.1% फॉर्मिक अम्लम् (H2O मध्ये), चलचरण B 90% एसीटोनिट्राइल, 0.1% फॉर्मिक अम्लम् अस्ति । LC ढालः १००% A कृते ० तः २ निमेषपर्यन्तं, ९९% B कृते २ तः ७.१ निमेषपर्यन्तं, ९९% B कृते ७.१ तः ८ निमेषपर्यन्तं भवति ततः ३ निमेषपर्यन्तं ०.६ ml/min प्रवाहवेगेन चलचरण A इत्यनेन सह स्तम्भस्य पुनः संतुलनं कुर्वन्तु . प्रवाहस्य गतिः ०.४ml/min भवति, स्तम्भकक्षं च ५०°C यावत् तापितं भवति । अवधारणसमयं (RT) परिवर्तनं च (RT = 0.882 मिनिट्, परिवर्तनं 1 = 137→94.1, परिवर्तनं 2 = 137→92 , परिवर्तनं 3 = 137→78) स्थापयितुं MNA इत्यस्य शुद्धरासायनिकमानकस्य (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) उपयोगं कुर्वन्तु। यदा त्रयः अपि संक्रमणाः सम्यक् धारणसमये भवन्ति तदा विशिष्टतां सुनिश्चित्य परिमाणनिर्धारणाय संक्रमणः १ उपयुज्यते । एमएनए (टोरोन्टो रिसर्च केमिकल कम्पनी) इत्यस्य मानकवक्रं स्टॉक घोलस्य (१ मिग्रा/एमएल) षट् क्रमिकक्षीणीकरणैः उत्पन्नं कृत्वा क्रमशः ०.१, १.०, १० तथा १०० एनजी/एमएल तथा १.० तथा १० माइक्रोग्राम/एमएल द्रवस्य मानकं प्राप्तम् अन्वेषणसीमा १ ng/ml भवति, रेखीयप्रतिक्रिया च १० ng/ml तः १०μg/ml यावत् भवति । नमूनायाः मानकस्य च प्रत्येकं इन्जेक्शनं LC/MS विश्लेषणार्थं उपयुज्यते, विश्लेषणमञ्चस्य स्थिरतां सुनिश्चित्य प्रत्येकं अष्टसु इन्जेक्शनेषु मिश्रितगुणवत्तानियन्त्रणनमूना चाल्यते सर्वेषां एमएनए-उपचारितकोशिका-नमूनानां एमएनए-प्रतिक्रियाः परीक्षणस्य रेखीय-परिधिमध्ये आसन् । MassHunter मात्रात्मकविश्लेषणसॉफ्टवेयर (v9.0, Agilent) इत्यस्य उपयोगेन आँकडाविश्लेषणं कृतम् ।
द्वितीयपीढीयाः αFR-CAR निर्माणं Song et al. (५९) इति । संक्षेपेण, निर्माणे निम्नलिखितसामग्रीः सन्ति: CD8a नेता अनुक्रमः, मानवीय αFR-विशिष्टः एकशृङ्खलाचरखण्डः, CD8a काजः तथा च झिल्लीपारक्षेत्रः, CD27 अन्तःकोशिकीयक्षेत्रं तथा CD3z अन्तःकोशिकीयक्षेत्रम्। सम्पूर्णं CAR अनुक्रमं GenScript द्वारा संश्लेषितं, ततः संप्रेषणदक्षतायाः मूल्याङ्कनार्थं प्रयुक्तस्य GFP अभिव्यक्तिकैसेट् इत्यस्य अपस्ट्रीमस्य द्वितीयपीढीयाः लेन्टिवायरस-अभिव्यक्ति-सदिशे क्लोनीकरणं कृतम्
लेन्टिवायरसः HEK293T कोशिकानां संक्रमणेन उत्पाद्यते [अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC); Dulbecco इत्यस्य परिवर्तिते ईगलमाध्यमे 10% भ्रूणगोजातीयसीरम (FBS) तथा 1% PenStrep युक्ते उगायते, तथा च CAR-GFP vector इत्यस्य उपयोगः कृतः तथा च The packaging plasmids (psPAX2 and pMD2.G, Addgene) इत्यनेन lipofection amine (Sigma-Aldrich) इत्यस्य उपयोगः कृतः संक्रमणस्य ४८ तथा ७२ घण्टानां अनन्तरं वायरसयुक्तं सुपरनेटेंट् एकत्रितं कृत्वा छानयित्वा अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूजेशनद्वारा सान्द्रीकृतम् । सान्द्रं वायरल सुपरनेटेंटं -80°C इत्यत्र संप्रेषणपर्यन्तं संग्रहयन्तु।
पीबीएमसी स्वस्थदाता ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादों (STEMCELL Technologies) से फिकोल ढाल घनत्व अपकेन्द्रीकरण द्वारा अलग किया जाता है। PBMC तः CD8+ कोशिकानां पृथक्करणार्थं सकारात्मकचयनस्य CD8 सूक्ष्ममणिस्य (Miltenyi) उपयोगं कुर्वन्तु । TransAct (Miltenyi) इत्यनेन सह तथा TexMACS माध्यमे [Miltenyi; 3% ताप-निष्क्रियमानवसीरम, 1% PenStrep तथा IL-2 (300 U/ml)] इत्यनेन पूरितम्] । उत्तेजनायाः चतुर्विंशतिः घण्टानन्तरं टी कोशिकानां लेन्टिवायरस (प्रति १०६ कोशिकासु १० μl सान्द्रं वायरसस्य सुपरनेटेन्ट्) इत्यनेन परिवर्तनं कृतम् । Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ इत्यत्र संप्रेषणस्य 1 तः 3 दिवसेभ्यः अनन्तरं, कोशिकानां GFP अभिव्यक्तिं मूल्याङ्कनं कृत्वा न्यूनातिन्यूनं 30% संप्रेषणदक्षतां प्रदर्शयन्तु
CAR-T कोशिकानां Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep इत्यनेन पूरकम्) इत्यस्मिन् 24 घण्टापर्यन्तं निम्नलिखितस्थितौ संवर्धितम् आसीत्: अउपचारितं, 250 μM एडेनोसिन अथवा 10 mM MNA इत्यनेन उपचारितम्। पूर्वउपचारस्य अनन्तरं CAR-T कोशिकानां PBS इत्यनेन प्रक्षालितं कृत्वा 20,000 SK-OV-3 कोशिकाभिः सह संयोजितम् [ATCC; in McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS and 1% PenStrep at 10: 1 इत्यस्य प्रभावक-लक्ष्य-अनुपातं पूरक-इम्यूनोकल्ट-माध्यमे त्रिगुणं प्रवर्धितम् आसीत् SK-OV-3 कोशिकानां तथा SK-OV-3 कोशिकानां डिजिटलिस सैपोनिन् (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) इत्यनेन लाइज्ड् कृताः क्रमशः नकारात्मक-सकारात्मक-नियन्त्रणरूपेण उपयुज्यन्ते स्म सह-संवर्धनस्य २४ घण्टानां अनन्तरं सुपरनेटेन्ट् एकत्रितं कृत्वा निर्मातुः निर्देशानुसारं (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) लैक्टेट् डिहाइड्रोजनेज (LDH) मापनं कृतम् एलडीएच सुपरनेटेन्ट् एलडीएच बफर इत्यस्मिन् १:५० क्षीणं कृतम् । वधस्य प्रतिशतं निम्नलिखितसूत्रस्य उपयोगेन मापितम् आसीत् : वधस्य प्रतिशतं = सुधारस्य प्रतिशतं / अधिकतमं वधस्य दरं x 100%, यत्र सुधारस्य प्रतिशतं = केवलं सह-संस्कृति-टी कोशिका, अधिकतमं वधस्य दरं च = सकारात्मकनियन्त्रण-नकारात्मकं नियन्त्रणम्।
यथा पाठे अथवा सामग्रीषु तथा पद्धतौ वर्णितं, सांख्यिकीयविश्लेषणार्थं GraphPad Prism 8, Microsoft Excel अथवा R v3.6.0 इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । यदि एकस्मात् रोगीतः (यथा जलोदरः, ट्यूमरः च) बहुविधाः नमूनाः एकत्रिताः भवन्ति तर्हि वयं युग्मित-टी-परीक्षायाः उपयोगं कुर्मः अथवा यथायोग्यं रेखीय-सामान्यीकृत-प्रतिरूपे यादृच्छिक-प्रभावरूपेण रोगी समावेशयन्ति मेटाबोलोमिक्स विश्लेषणार्थं महत्त्वपरीक्षा त्रिप्रतिकृता भवति ।
अस्य लेखस्य पूरकसामग्रीणां कृते कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 पश्यन्तु
एषः क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-वाणिज्यिक-अनुज्ञापत्रस्य शर्तानाम् अन्तर्गतं वितरितः मुक्त-प्रवेश-लेखः अस्ति, यः कस्मिन् अपि माध्यमे उपयोगं, वितरणं, पुनरुत्पादनं च अनुमन्यते, यावत् अन्तिमः उपयोगः व्यावसायिकलाभार्थं न भवति तथा च आधारः अस्ति यत् मूलकार्यं सम्यक् अस्ति सन्दर्भः।
नोटः- वयं केवलं भवन्तं भवतः ईमेल-सङ्केतं प्रदातुम् याचयामः येन भवन्तः पृष्ठे अनुशंसिताः व्यक्तिः ज्ञास्यति यत् भवन्तः इच्छन्ति यत् ते ईमेल-पत्रं द्रष्टुम् इच्छन्ति तथा च एतत् स्पैम् नास्ति इति। वयं किमपि ईमेल-सङ्केतं न गृह्णीमः ।
एषः प्रश्नः भवान् आगन्तुकः अस्ति वा इति परीक्षितुं स्वयमेव स्पैम-प्रदानं निवारयितुं च उपयुज्यते ।
मारिसा के किलगौर (मारिसा के किलगौर), सारा मैकफर्सन (सारा मैकफर्सन), लॉरेन जी जकर्यायस (लॉरेन जी जकर्यायस), अबीगैल एली एरिस जी वाटसन (एच वाटसन), जॉन स्टैग (जॉन स्टैग), ब्रैड एच नेल्सन (ब्राड एच नेल्सन), राल्फ जे डी बेलार्डिनी (राल्फ जे डिबेरडिनिस्), रसेल जी जोन्स (रूसेल जी जोन्स), फिनियस टी हैमिल्टन (फिनियस टी.
एमएनए टी कोशिकानां प्रतिरक्षादमनं योगदानं करोति तथा च मानवकर्क्कटस्य चिकित्सायाः सम्भाव्यप्रतिरक्षाचिकित्सालक्ष्यस्य प्रतिनिधित्वं करोति ।
मारिसा के किलगौर (मारिसा के किलगौर), सारा मैकफर्सन (सारा मैकफर्सन), लॉरेन जी जकर्यायस (लॉरेन जी जकर्यायस), अबीगैल एली एरिस जी वाटसन (एच वाटसन), जॉन स्टैग (जॉन स्टैग), ब्रैड एच नेल्सन (ब्राड एच नेल्सन), राल्फ जे डी बेलार्डिनी (राल्फ जे डिबेरडिनिस्), रसेल जी जोन्स (रूसेल जी जोन्स), फिनियस टी हैमिल्टन (फिनियस टी.
एमएनए टी कोशिकानां प्रतिरक्षादमनं योगदानं करोति तथा च मानवकर्क्कटस्य चिकित्सायाः सम्भाव्यप्रतिरक्षाचिकित्सालक्ष्यस्य प्रतिनिधित्वं करोति ।
©2021 अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द एडवांसमेण्ट् आफ् साइंस। सर्वे अधिकाराः सुरक्षिताः। एएएएस HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef तथा COUNTER इत्येतयोः भागीदारः अस्ति । विज्ञान उन्नति ISSN 2375-2548.