Nature.com इत्यत्र गमनार्थं धन्यवादः।भवन्तः यत् ब्राउजर् संस्करणं उपयुञ्जते तस्य CSS कृते सीमितसमर्थनम् अस्ति।उत्तम-अनुभवाय वयं अनुशंसयामः यत् भवान् अद्यतन-ब्राउजरस्य उपयोगं करोतु (अथवा Internet Explorer मध्ये संगतता-विधिं अवरम्भयतु)।अस्मिन् मध्ये, निरन्तर-समर्थनं सुनिश्चित्य, वयं शैल्याः, JavaScript च विना साइट् प्रदर्शयिष्यामः।
मेरुदण्डजीवानां विपरीतम्, कीटानां व्यापकरूपेण पुरुषपक्षपातपूर्णसेक्सस्टेरॉयडहार्मोनानाम् अभावः इति चिन्तितम् अस्ति।एनोफिलीजगम्बिया इत्यस्मिन् एक्डाइसोन् स्टेरॉयड् २०-हाइड्रोक्सीएक्डाइसोन (20E) इत्यस्य विकासः मादाभिः संश्लेषितस्य अण्डस्य विकासं नियन्त्रयितुं2 तथा च पुरुषैः3.अण्डविकासात् यौनरूपेण स्थानान्तरिते संभोगप्रतिरोधककालं प्रेरयितुं विकसितः इति प्रतीयते तथा संभोगः आवश्यकाः प्रजननलक्षणाः सन्ति, एतत् अवगत्य कथं मादा एनोफिलीज मशकाः एतान् हार्मोनलसंकेतान् एकीकृत्य नूतनानां मलेरिया नियन्त्रणकार्यक्रमानाम् डिजाइनं सुलभं कर्तुं शक्नुवन्ति।अत्र, वयं प्रकाशयामः यत् एते प्रजननकार्यं ecdysteroid-सक्रिय/निष्क्रिय एन्जाइमस्य जटिलजालस्य माध्यमेन विशिष्ट-लिंग-स्टेरॉयड् द्वारा नियमितं भवति।अस्माभिः एकं पुरुष-विशिष्टं आक्सीकृतं ecdysone, 3-dehydro-20E (3D20E), यत् यौनस्थानांतरणस्य अनन्तरं महिलानां यौनग्राहकतां बन्दं कृत्वा मातापितृत्वस्य रक्षणं करोति तथा च डिफॉस्फोरिलेशनद्वारा सक्रियताम्।उल्लेखनीयरूपेण, 3D20E स्थानान्तरणेन प्रजननजीनानां अभिव्यक्तिः अपि प्रेरिता ये प्लाज्मोडियमसंक्रमणस्य समये अण्डस्य विकासं निर्वाहयन्ति, येन संक्रमितमहिलानां स्वास्थ्यं सुनिश्चितं भवति।महिला-उत्पन्नं 20E यौनसम्बन्धं न उत्पन्नं करोति प्रतिक्रिया, परन्तु 20E-निरोधक-किनेस्-इत्यस्य निरोधस्य अनन्तरं संभोग-व्यक्तिभ्यः अण्डं दातुं अनुमतिं ददाति ।अस्य पुरुष-विशिष्ट-कीट-स्टेरॉयड्-हार्मोनस्य पहिचानः तथा च महिलानां यौन-ग्राहकता, प्रजनन-क्षमता, प्लाज्मोडियम-सह-अन्तर्क्रिया च नियमने तस्य भूमिका मलेरिया-सञ्चारक-मशकानाम् प्रजनन-सफलतां न्यूनीकर्तुं क्षमतां सूचयति
मलेरियाप्रकरणाः मृत्युः च पुनः वर्धमानाः सन्ति4 मानवमलेरियापरजीविनां एकमात्रसञ्चारकेषु एनोफिलीजमशकेषु व्यापककीटनाशकप्रतिरोधस्य कारणतः।एतेषां मशकानां संभोगजीवविज्ञानं नवीनमलेरियानियन्त्रणहस्तक्षेपाणां विशेषतया आकर्षकं लक्ष्यं भवति यतोहि मादाः केवलं एकवारं संभोगं कुर्वन्ति एतत् एकमेव संभोगघटना बाँझं कृत्वा क्षेत्रे मशकजनसंख्यां न्यूनीकर्तुं महती सम्भावना भविष्यति ।
पुरुषाणां उच्च-टीटर-स्टेरॉयड्-हार्मोनं प्राप्य महिलाः यौन-अक्षमतां प्राप्नुवन्ति।अध्ययनेन ज्ञातं यत् अग्रे संभोगे कठिनतायाः उत्प्रेरकः 20-हाइड्रोक्सीएक्डाइसोन् (20E) अस्ति, यः लार्वा-पदे मोल्टिंग्-चक्रस्य नियामकरूपेण अधिकतया प्रसिद्धः स्टेरॉयड्-हार्मोनः अस्ति।पुरुषाणां 20E संश्लेषणं स्थानान्तरणं च कर्तुं क्षमता विशेषतया 20E मध्ये विकसिता अस्ति एनोफिल्स् प्रजातयः ये उपजातेः सेलिया७ भागाः सन्ति, यत् आफ्रिकादेशे वितरितम् अस्ति तथा च एनोफिल्स् गैम्बिया सहितं मलेरियायाः अत्यन्तं खतरनाकाः संवाहकाः समाविष्टाः सन्ति।एतत् विशेषतया उल्लेखनीयम् अस्ति यतोहि एतेषु प्रजातीषु मादाः प्रत्येकं रक्तभोजनानन्तरं 20E अपि उत्पादयन्ति, तथा च 20E ओजननेसिसचक्रं चालयति (द्रष्टव्यम् संदर्भः 8)।तथापि मादाः एकीकरणस्य मार्गस्य विषये अल्पं ज्ञायते एकडाइसोनस्य द्वयोः भिन्नस्रोतयोः (पुरुषस्थानांतरणं रक्तभोजनप्रवर्तनं च) संकेतं प्राप्नुवन्ति, स्वस्य संभोगक्षमतायाः सम्झौतां विना।वास्तवतः यदि महिलाभिः उत्पादितः 20E यौन असहिष्णुतां प्रेरयति तर्हि एतेन कुमारीभोजनं कुर्वतां व्यक्तिषु वंध्यत्वं भविष्यति, एतेषु मशकेषु अतीव सामान्यः व्यवहारः
एकं सम्भाव्यं व्याख्यानं अस्ति यत् ए.गैम्बिया पुरुषाः परिवर्तितं पुरुषविशिष्टं एक्डाइसोन् स्थानान्तरयन्ति, यत् महिलाप्रजननमार्गे संकेतप्रवाहं सक्रियं करोति, यस्य परिणामेण संभोगस्य अस्थिरता भवति।तथापि, यद्यपि कशेरुकाणां बहुविधाः स्टेरॉयड् हार्मोनाः सन्ति, यथा एस्ट्रोजनः एण्ड्रोजेन् च (संदर्भ 9 मध्ये समीक्षितः), अस्माकं ज्ञाने एण्ड्रोजेनिक-पक्षपातयुक्तानां स्टेरॉयडानां पहिचानः अस्मिन् न कृतः कीटाः ।
वयं सम्भाव्यसंशोधकस्टेरॉयड् इत्यस्य अन्वेषणार्थं यौनपरिपक्वस्य ए.गैम्बिया इत्यस्य पुरुषपुरुषसहायकग्रन्थि (MAG) इत्यस्मिन् स्टेरॉयड् हार्मोनस्य रेपर्टरी निर्धारयितुं प्रस्थितवन्तः।पूर्वं प्रयुक्तस्य न्यूनविशिष्टपद्धतेः अपेक्षया टैण्डम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-MS/MS) इत्यनेन सह युग्मित उच्चप्रदर्शनद्रवक्रोमैटोग्राफी इत्यस्य उपयोगेन, अस्मिन् ऊतके एक्डिसोन् (E) तथा 20E इति पत्ताङ्गीकृतवन्तः, येन पूर्वं पुष्टिः कृता result.However, नमूने आक्सीडाइज्ड फॉस्फोरिलेशन स्टेरॉयड् द्वारा प्रधानता आसीत्, सूत्र 3-dehydro-20E22P)12 (चित्र 1).अन्य रूपेषु 3-dehydro-20E (3D20E) तथा 20E-22-फॉस्फेट (20E22P) सहित 3D20E22P तस्य विफॉस्फोरिलेशनरूपस्य 3D20E इत्यस्मात् द्वौ क्रमौ अधिकः आसीत्, तथा च E तथा 20E (चित्रम् 1) इत्यस्मात् त्रयः क्रमाः अधिकः आसीत्।यद्यपि शरीरस्य अन्येषु भागेषु तथा निम्नप्रजननमार्गेषु (LRT; Extended Data Fig. 1a).अस्माभिः नवनिबद्धेषु (<1 दिवसीयेषु) पुरुषेषु ecdys अपि विश्लेषणं कृतम् महिलाः तथा केवलं MAG इत्यस्मिन् 3D20E तथा 3D20E22P इति ज्ञाताः; E, 20E तथा 20E22P उभयलिंगेषु उपस्थिताः आसन् (Extended Data Fig. 1b)।एते आँकडानि सूचयन्ति यत् A. gambiae वयस्कपुरुषाः स्वस्य MAGs मध्ये परिवर्तनकारी हार्मोनस्य उच्चटीटरं उत्पादयन्ति ये महिलाभिः संश्लेषिताः न भवन्ति।
MAG तथा महिला LRT (अलिन्द, वीर्यपुटिका, तथा पैरोवेरियम सहित) 4 दिवसीय (4 दिवसीय) कुमारी पुरुषों तथा कुमारी तथा संभोग मादा (0.5, 3, तथा 12 hpm) इत्येतयोः विच्छेदनं कृतम्।एतेषु ऊतकयोः Ecdysone इत्यस्य विश्लेषणं HPLC-MS/MS (mean ± sem; unpaired t-test, two-sided,) द्वारा कृतम्। मिथ्या खोज दर (FDR) सही किया गया; 3 घण्टा बनाम 0.5 घण्टा, P = 0.25;12 घण्टा बनाम 3 घण्टा, P = 0.0032;12 घण्टा बनाम 0.5 घण्टा, P = 0.015)।दत्तांशः त्रयाणां जैविकप्रतिकृतीनां कृते अस्ति।रुचिस्य प्रत्येकस्य एकडाइसोनस्य शिखरक्षेत्रस्य गणना मशकानाम् संख्यायाः द्वारा सामान्यीकृता च आसीत्। २०ई, नारङ्गः; २०ई२२P, बैंगनी; ३D२०ई, नीलवर्णः; 3D20E22P, गुलाबी।इनसेट् y-अक्षे स्केलं वर्धयति यत् न्यूनतरं ecdysone स्तरं दर्शयति।
संभोगस्य समये 3D20E22P तथा 3D20E स्थानान्तरिताः भवन्ति वा इति अन्वेषणार्थं वयं संभोगस्य अनन्तरं विभिन्नसमयबिन्दुषु मादा LRTs विच्छेदनं कृतवन्तः।यद्यपि कुमारीषु ecdysone न प्राप्तम्, तथापि संभोगस्य तत्क्षणानन्तरं LRT मध्ये 3D20E22P इत्यस्य पर्याप्तमात्रायां (0.5 h post-mating, hpm), कालान्तरे न्यूनतां प्राप्य, while 3D20E स्तरः महत्त्वपूर्णतया वर्धितः (चित्र 1).रासायनिकरूपेण संश्लेषितं 3D20E मानकरूपेण उपयुज्य अस्माभिः निर्धारितं यत् संभोगस्य LRTs इत्यस्मिन् अस्य स्टेरॉयड् हार्मोनस्य स्तरः 20E इत्यस्मात् न्यूनातिन्यूनं 100-गुणाधिकः आसीत् (विस्तारितः आँकडा सारणी 1)।एवं 3D20E22P प्रमुखः पुरुषः ecdysone अस्ति यः संभोगस्य समये महिला LRT मध्ये स्थानान्तरितः भवति, तथा च तस्य विफॉस्फोरिलेशनरूपं 3D20E संभोगस्य किञ्चित्कालानन्तरं अत्यन्तं प्रचुरं भवति।एतत् महिलासंभोगोत्तरजीवविज्ञाने उत्तरार्धस्य एक्डाइसोनस्य महत्त्वपूर्णां भूमिकां सूचयति।
एकं नवीनं आरएनए अनुक्रमण (RNA-seq) डाटासेटं (चित्र 2a) उत्पन्नं कृत्वा, कस्टम-निर्मितस्य जैवसूचनाशास्त्रस्य पाइपलाइनस्य उपयोगेन, अस्माभिः ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), तथा ecdysone एन्कोडिंग 20E-संशोधित फॉस्फेटेज जीन.EPP) प्रजनन ऊतकयोः अभिव्यक्तं भवति इति अन्वेषणं कृतम् संभावित EcK जीन (EcK1 तथा EcK2), परन्तु एकं उत्तमं उम्मीदवार EO जीनम् अन्वेष्टुं असमर्थाः आसन्।उल्लेखनीयरूपेण, व्यक्तिगत EPP जीनाः गैम्बिया MAGs इत्यत्र उच्चस्तरेन (98.9th percentile) अभिव्यक्ताः आसन् परन्तु महिला LRTs (चित्र 2b) इत्यत्र न, अस्माकं अपेक्षायाः विपरीतम् यतः 3D20E22P इत्यस्य डिफॉस्फोरिलेशनं अस्मिन् महिला ऊतके अभवत्।अतः, अस्माकं विश्वासः अस्ति that male EPP may be transferred during mating.Indeed, we used in vivo stable isotope labeling to mask to mating after female atrium (चित्र 2c तथा पूरकसारणी 1) MS द्वारा चिह्नित एन्जाइम (चित्र 2c तथा पूरकसारणी 1).MAG मध्ये EPP तथा संभोग (किन्तु कुमारी न) मादा LRT मध्ये EPP इत्यस्य उपस्थितिः अपि विशिष्टप्रतिपिण्डानां उपयोगेन पुष्टिः कृता (चित्र 2d)।
क, प्रत्येकस्य लिंगस्य प्रजनन ऊतकानाम् अन्वेषणार्थं EcKs, EOs, EPPs च एन्कोडिंग् जीनानां कृते अनुकूलितरूपेण निर्मितं जैवसूचनाशास्त्रपाइपलाइनम्।बाणानां पार्श्वे सङ्ख्याः प्रत्येकस्मिन् चरणे पुरुष-महिला-अभ्यर्थीनां संख्यां सूचयन्ति।अस्मिन् विश्लेषणे एकं EPP जीनम् (EPP) एकं EcK जीनं (EcK1) च चिह्नितं यत् पुरुषेषु अभिव्यक्तं भवति, तथा च एकं EcK जीनम् (EcK2) यत् उभयलिंगेषु अभिव्यक्तं भवति परन्तु उम्मीदवारं EO जीनं न ददाति।b, कुमारी (V) तथा संभोग (M) एनोफिलीज गैम्बिया तथा एनोफिलीज अल्बिकनस ऊतकयोः उम्मीदवारजीनव्यञ्जनस्य तुलनां कुर्वन् हीटमैपः।Spca, निषेचन पुरुषेषु MAGs, सहायकग्रन्थिः; शरीरस्य अन्यभागाः, यत्र उभयलिंगेषु स्तन, पक्षाः, पादौ, वसाशरीराणि, आन्तरिकाः अङ्गाः च सन्ति, तथा च महिलासु अण्डकोषाः सन्ति।EcK2 गाम्बियादेशस्य MAG तथा अलिन्दयोः द्वयोः अपि अत्यधिकं अभिव्यक्तं भवति, यदा तु EPP केवलं MAG.c, Proteomic analysis of male ejaculate group translocation in female atria at 3, 12 and 24 hpm, showing the 67 most abundant proteins.Females were raised on a diet containing 15N to label (and mask) all proteins.अनटैग्ड् पुरुषाः टैगकृतमहिलानां सह संभोगं कृतवन्तः, तथा च महिलानां LRTs इत्यस्य प्रोटीओमिकविश्लेषणार्थं 3, 12 तथा 24 hpm इत्यत्र विच्छेदनं कृतम् (स्खलनप्रोटीनानां सम्पूर्णसूचनार्थं पूरकसारणी 1 पश्यन्तु)।Inset, EPP, Eck1 तथा एतेषां ऊतकानाम् प्रोटीओमिकविश्लेषणेन कुमारीपुरुषाणां MAG मध्ये EcK2 ज्ञायते स्म।d, संभोगकृतमहिलानां MAG तथा LRT इत्यत्र वेस्टर्न ब्लॉट् द्वारा EPP ज्ञायते स्म, परन्तु कुमारी मादासु वा पुरुषेषु वा शेषस्त्रीशरीरे न।झिल्लीषु एकत्रितरूपेण एण्टी-एक्टिन (लोडिंग् कंट्रोल) तथा एण्टी-ईपीपी एण्टीबॉडीभिः अन्वेषणं कृतम् आसीत्।सभी पुरुषाः कुमारिकाः सन्ति।See जेलस्रोतदत्तांशस्य कृते पूरकचित्रम् १।वेस्टर्न ब्लॉट् द्विवारं समानपरिणामेन सह कृतम्।
EPP इत्यस्य ecdysteroid phosphophosphatase गतिविधिः MAG (Extended Data Fig. 2a) इत्यस्मात् पृथक्कृतेन 3D20E22P इत्यनेन सह ऊष्मायनानन्तरं HPLC-MS/MS द्वारा सत्यापितम् आसीत्।तदतिरिक्तं, यदा वयं RNA-मध्यस्थतायुक्तहस्तक्षेपेण (RNAi) EPP इत्यस्य मौनं कृतवन्तः, तदा अस्माभिः एतेषां पुरुषाणां (चित्र 3a), तथा च महिलानां प्रजनन ऊतकयोः फॉस्फेटेजक्रियाकलापस्य प्रबलं न्यूनीकरणं ज्ञातम् mated with EPP-silenced males showed significant आंशिक जीन मौनीकरणस्य अभावे dephosphorylated 3D20E (चित्र 3b) इत्यस्य न्यूनः अनुपातः (विस्तारितः आँकडा चित्रः 2b,c)।तस्य विपरीतम्, अस्माभिः समानमशकेषु 20E22P/20E अनुपाते महत्त्वपूर्णपरिवर्तनं न ज्ञातम्, यत् सूचयितुं शक्नोति यत् एन्जाइमः 3D20E22P कृते विशिष्टः अस्ति (चित्र ३ख) ।
क, डबल-स्ट्रैण्ड् ईपीपी आरएनए (dsEPP) अथवा डबल-स्ट्रैण्ड् जीएफपी आरएनए (dsGFP) नियन्त्रणानां उपयोगेन ईपीपी-मौनीकरणेन कारणेन MAG मध्ये फॉस्फेटेज-क्रियाकलापस्य न्यूनता।प्रत्येकप्रतिकृतौ (P = 0.0046, युग्मित-टी-परीक्षणं, द्विपक्षीयं), पृथक्-पृथक् बिन्दुभिः प्रतिनिधित्वं कृतम्।b, ईपीपी-मौनीकरण-कृतैः पुरुषैः सह संभोगं कृतवन्तः मादाः ए 3 एचपीएम (P = 0.0043, अयुग्मित टी-परीक्षण, द्विपक्षीय) पर डिफॉस्फोरिलेशन 3D20E इत्यस्य महत्त्वपूर्णतया न्यूनः अनुपातः, यदा तु 20E स्तरः अप्रभावितः (P = 0.063, अयुग्मितः) आसीत् t-test, two-sided).Data are presented as mean ± sem from three pools of three pools of 13, 16 and 19 females each.c, ईपीपी-मौनकृतपुरुषैः सह संभोगं कृतवन्तः मादाः पुनः संभोगस्य महत्त्वपूर्णतया अधिकाः दराः आसन् (P = 0.0002, Fisher's exact test, two-sided).मादाः प्रथमं संभोगस्य स्थितिं सुनिश्चित्य संभोगं कर्तुं बाध्यतां प्राप्तवन्तः २ दिवसाभ्यन्तरे, तेषां सम्पर्कः ट्रांसजेनिकशुक्राणुवाहकैः अन्यैः पुरुषैः सह कृतः यत् ट्रांसजीनस्य मात्रात्मकपीसीआर-परिचयेन पुनः संभोगदरस्य आकलनं कृतम् ।d, ईपीपी-मौनकृतपुरुषैः सह संभोगं कृत्वा रक्तपोषितमादासु प्रजननक्षमतायां महती न्यूनता अभवत् (P < 0.0001; Mann-Whitney test, two-sided) तथा च अण्डसङ्ख्यायां किञ्चित् न्यूनता अभवत् (P = 0.088, Mann-Whitney test, two-sided) , यदा स्पॉनिंगदरः प्रभावितः नासीत् (P = 0.94, Fisher’s exact test, two-sided).सर्वेषु पटलेषु n जैविकरूपेण स्वतन्त्रमशकनमूनानां संख्यां प्रतिनिधियति।NS, महत्त्वपूर्णं नास्ति।*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < ०.००१ इति ।
तदनन्तरं, अस्माभिः मूल्याङ्कनं कृतम् यत् मादासु संभोगप्रतिरोधं प्रेरयितुं ecdysone dephosphorylation महत्त्वपूर्णम् अस्ति वा।उल्लेखनीयरूपेण, EPP-क्षीणपुरुषैः सह संभोगं कृतवन्तः मादाः अतिरिक्त (ट्रांसजेनिक) पुरुषाणां सम्पर्कं कृत्वा नियन्त्रणमादाभ्यः (10.4%) अपेक्षया बहु अधिकतया (44.9%) पुनः संभोगं कृतवन्तः (चित्र 3c)।अस्माभिः प्रजननक्षमतायां महती न्यूनता अपि अवलोकिता (चित्रम् 3d, वाम) तथा च एतेषां मादानां अण्डानां संख्यायां किञ्चित् न्यूनता (चित्रम् 3d, मध्यम्), यदा तु मादाभिः अण्डानां प्रतिशतं (मादासु संभोगद्वारा उत्पन्ना अन्यः प्रतिक्रिया )) प्रभाविता न अभवत् (चित्र 3d, दक्षिणम्)।3D20E22P कृते EPP इत्यस्य अवलोकितविशिष्टतां दृष्ट्वा एते परिणामाः सूचयन्ति यत् संभोगस्य समये स्थानान्तरितस्य EPP द्वारा 3D20E इत्यस्य अग्रे संभोगस्य कृते महिलायाः ग्रहणशीलतां निष्क्रियं कर्तुं महत्त्वपूर्णा भूमिका भवितुमर्हति, एषः व्यवहारः पूर्वं 20E इत्यस्य यौनस्थानांतरणस्य कारणम् आसीत् ।अतः अयं पुरुषविशिष्टः हार्मोनः महिलानां प्रजननशक्तिं अपि प्रबलतया प्रभावितं करोति
तदनन्तरं, वयं रासायनिकरूपेण संश्लेषितं 3D20E (चित्रम् 4a–c) तथा व्यावसायिकरूपेण उपलब्धं 20E इत्यस्य उपयोगेन यौनपरिपक्वकन्यासु इन्जेक्शनप्रयोगेषु 20E तथा 3D20E इत्येतयोः क्रियाकलापयोः तुलनां कृतवन्तः।अस्माभिः अवलोकितं यत् 3D20E उभयसान्द्रतासु (चित्र 4d) संभोगस्य प्रति महिलासंवेदनशीलतां बन्दं कर्तुं 20E इत्यस्मात् महत्त्वपूर्णतया अधिकं प्रभावी आसीत्।उल्लेखनीयं यत्, आधा एलआरटी इत्यस्मिन् 3D20E इत्यस्य शारीरिकस्तरः (1,066 pg injection post-injection vs. 2,022 pg post-mating) अप्रतिरोधकमहिलानां अनुपातं प्रेरितवान् यत् 20E (361 pg post-injection) इत्यस्य शारीरिकस्तरात् 20-गुणं अधिकम् आसीत्, अधिकतमसान्द्रतायां 18 pg post-mating इत्यत्र विस्तारिता आँकडा सारणी 1).एतत् परिणामं एतस्य धारणायाः अनुरूपं भवति यत् 20E इत्यस्य यौनस्थानांतरणं संभोगप्रतिरोधककालस्य कारणं न भवति, तथा च मातापितृ-बालसम्बन्धं सुनिश्चित्य 3D20E इत्यस्य प्रमुखकारकत्वेन अग्रे सूचयति।3D20E कुमारी-मादासु अण्ड-अर्पण-परीक्षणेषु 20E इत्यस्मात् अपि महत्त्वपूर्णतया अधिकं सक्रियः आसीत् (चित्र 4e), यत् सूचयति यत् सामान्य-अण्ड-प्रदान-दरः वयं आंशिक ईपीपी मौनीकरणस्य अनन्तरं अवलोकितं अवशिष्टं 3D20E क्रियाकलापस्य उपस्थितेः कारणेन आसीत् यत् अद्यापि संभोग-प्रेरितैः महिलाकारकैः उत्पादितम् आसीत्
(a,b) 20E (a) तः रासायनिकरूपेण संश्लेषितं 3D20E अत्यन्तं उच्चरूपान्तरण/दक्षता (त्रिषु स्वतन्त्रसंश्लेषणप्रतिक्रियाभ्यः औसत ± sem रूपेण प्रस्तुतः आँकडा) (b).c, द्रव्यमानस्पेक्ट्रम (नीचः आधा) संभोगयुक्ता मादा LRT (शीर्षार्ध) इत्यस्मिन् प्राप्ते ecdysone इत्यनेन सम्यक् मेलनं करोति।d, 20E (0.63 μg, P =) इत्यनेन सह तुलने 0.02;0.21 μg, P < 0.0001; (0.63 μg, P = 0.0002; 0.21 μg, P = 0.54; Fisher's exact test, 2-sided).e, 3D20E इन्जेक्शनेन 10% इथेनॉलनियन्त्रणानां (0.21 μg, P < 0.0001; 0.13) अपेक्षया कुमारी मादासु महत्त्वपूर्णतया अधिकाः स्पॉनिंगदराः प्रेरिताः μg, p = 0.0003; अधिकमात्रा (0.21 μg, P = 0.0019; 0.13 μg, P = 0.075; फिशरस्य सटीकपरीक्षणं, द्विपक्षीयम्)।सर्वपटलेषु, n जैविकरूपेण स्वतन्त्रमशकनमूनानां संख्यां प्रतिनिधियति।NS, महत्त्वपूर्णं नास्ति।*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.दत्तांशः त्रयाणां प्रतिकृतीनां भवति।
पूर्वाध्ययनेषु अस्माभिः निर्धारितं यत् स्टेरॉयड् हार्मोनस्य यौनहस्तांतरणं MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) इत्यस्य अभिव्यक्तिं प्रेरयति, यत् एकः महिला प्रजननजीनः A. gambiae महिलानां रक्षणं करोति P. falciparum संक्रमणात् स्वास्थ्यव्ययस्य कारणं 13, घातकतमस्य मानवमलेरिया परजीवी।Anopheles इत्यस्य प्रजननसुष्ठुतायै MISO इत्यस्य महत्त्वं दृष्ट्वा मलेरिया-स्थानिकक्षेत्रेषु, अस्माभिः निर्धारयितुं निश्चयः कृतः यत् कोऽपि हार्मोनः 3D20E अथवा 20E अस्य जीनस्य अभिव्यक्तिं प्रेरयति।अस्माभिः ज्ञातं यत् यदा 20E इन्जेक्शनेन विशेषतया वा अधिकतया वा केचन परमाणुहार्मोनग्राहकाः (HR), यथा HR3 तथा HR4, तथा च विशिष्टानि अधःप्रवाहस्य स्टेरॉयड् लक्ष्याणि, यथा yolkogenic जीन Vg14, 15, 16, MISO अधिकं प्रेरितम् strongly was induced by 3D20E (Extended Data Fig. 3).एवं, अस्य एण्ड्रोजेनिक स्टेरॉयड् हार्मोनस्य यौनस्थानांतरणं तादृशान् तन्त्रान् प्रेरयति इति प्रतीयते यत् परजीवीसंक्रमणेन उत्पन्नव्ययात् महिलानां रक्षणं करोति।तदतिरिक्तं, 3D20E EcR-A इत्यस्य समरूपद्वयं भिन्नरूपेण प्रभावितं करोति, EcR-A तथा पुनः दबावं प्रेरयति EcR-B, तथा च HPX15 सहितं अन्येषां संभोग-प्रेरक-जीनानां अधिक-सशक्ततया प्रवर्तनं, यत् महिला-प्रजननशीलतां प्रभावितं करोति।एतत् EPP-मौन-कृत-पुरुषैः सह संभोग-कृतेषु मादासु अवलोकितां महत्त्वपूर्णं वंध्यतां व्याख्यातुं शक्नोति (विस्तारित-आँकडा चित्रम् 3)।एते आँकडा: अधःप्रवाहमार्गानां अस्तित्वं सूचयन्ति ये लिंग-विशिष्ट-कार्यस्य अन्तर्गतं भवितुमर्हन्ति।
तदनन्तरं, अस्माभिः अस्माकं जैवसूचनाविज्ञानपाइपलाइने चिह्नितयोः EcK जीनयोः कार्यस्य परीक्षणं कृतम्।EcK1 अथवा EcK2 इत्यस्य मौनीकरणस्य परिणामेण पुरुषेषु महत्त्वपूर्णमृत्युः अभवत् (विस्तारितः आँकडा चित्रम् 4a), यत् सूचयति यत् ecdysone phosphorylation, तथा च निष्क्रियीकरणं, जीवितस्य कृते महत्त्वपूर्णम् अस्ति।यतोहि EcK2 EcK1 इत्यस्मात् अधिकस्तरस्य अभिव्यक्तं कृतम् आसीत् तथा च MAGs इत्यनेन MAGs इत्यत्र ज्ञायते स्म proteomics (चित्र 2b,c तथा पूरकसारणी 2), वयं 20E सह इन्क्यूबेशनं कृत्वा तस्य ecdysteroid kinase गतिविधिं प्रमाणीकृतवन्तः, यस्य परिणामेण फॉस्फोरिलेशन 20E22P (विस्तारित आँकडा चित्र 2).4b).3D20E सब्सट्रेटरूपेण उपयोगं कुर्वन्, वयं फॉस्फोरिलेशन उत्पाद 3D20E22P (विस्तारित आँकडा चित्र 4c) अन्वेषणं कर्तुं असमर्थाः आसन्, यत् सूचयति यत् 3D20E इत्यस्य अपेक्षया 20E इत्येतत् EcK2 इत्यस्य प्राधान्यं लक्ष्यं भवितुम् अर्हति ।
अस्माकं RNA-seq विश्लेषणस्य अनुसारं EcK2 कुमारीमादानां LRT मध्ये अपि अत्यधिकं अभिव्यक्तम् आसीत्, यत्र संभोगस्य अनन्तरं निष्क्रियः आसीत् (चित्र 2b)।अस्माभिः एतेषां आँकडानां पुष्टिः कृता तथा च निर्धारितं यत् EcK2 अभिव्यक्तिः रक्तभोजनेन प्रभाविता न भवति (विस्तारितदत्तांशः चित्र 5a)।अस्माकं प्रारम्भिकं MS प्रयोगान् विस्तारयित्वा वयं निर्धारितवन्तः यत् 20E22P इत्यस्य शिखरं शिखरस्य निकटतया सम्बद्धम् अस्ति of 20E (22-26 hours after blood meal; Extended Data Fig. 5b).कुमारी महिलासु EcK2 इत्यस्य मौनीकरणस्य परिणामेण रक्तभोजनस्य 26 घण्टानां पश्चात् 20E तः 20E22P इत्यस्य सापेक्षिक-अनुपातस्य 3-गुणा वृद्धिः अभवत् (विस्तारित-आँकडा चित्राणि 2c तथा 5c), येन पुष्टिः अभवत् यत् EcK2 अपि 20E in females.Notably, EcK2-क्षीण कुमारिकाः पूर्णयौनग्राहकतां निर्वाहयन्ति स्म (Extended Data Fig. 5d,e), यत् अग्रे सूचयति यत् 20E इत्यस्य मादा उत्पादनं संभोगप्रतिरोधककालं न प्रेरयति।तथापि, एतेषु मादासु नियन्त्रणानां तुलने अण्डस्थापनस्य दरं महत्त्वपूर्णतया वर्धितम् आसीत्, यत्र 30% तः अधिकाः कुमारिकाः अण्डं दत्तवन्तः (Extended Data Fig. 5f).यदि रक्तपोषणस्य अनन्तरं द्विधातुयुक्तं Eck2 RNA (dsEcK2) इन्जेक्शनं कृतम् आसीत् तर्हि स्पॉनिंग् न अभवत्, यस्मिन् बिन्दौ रक्तस्य सेवनस्य कारणेन 20E शिखरं न्यूनीकृतम् आसीत्।समग्रतया एते परिणामाः एकस्य प्रतिरूपस्य समर्थनं कुर्वन्ति यत् रक्तचूषणानन्तरं उत्पादितः 20E स्पॉनिंग् प्रेरयितुं शक्नोति, परन्तु तदा एव स्पॉनिंग् ब्लॉक् (EcK2 तथा सम्भवतः अन्ये कारकाः) परिवर्तन्ते off by mating.न तु 20E न च 3D20E इन्जेक्शन् इत्यनेन कुमारीषु EcK2 अभिव्यक्तिः निरुद्धः (विस्तारितः आँकडा चित्रः 5g), यत् सूचयति यत् अन्ये कारकाः अस्य किनेजस्य निरोधस्य मध्यस्थतां कुर्वन्ति।तथापि, रक्तभोजनस्य अनन्तरं 20E स्तरः संभोगस्य असुविधां प्रेरयितुं पर्याप्तः नासीत्, परन्तु यौनरूपेण स्थानान्तरितस्य 3D20E इत्यस्य उच्चस्तरीयैः प्रभावीरूपेण प्रेरितम् आसीत्।
अस्माकं परिणामाः ए.गैम्बिया इत्यस्य प्रजननसफलतां नियन्त्रयन्तः तन्त्राणां विषये महत्त्वपूर्णानि अन्वेषणं प्रददति।एकं प्रतिरूपं उद्भूतम् अस्ति यत्र पुरुषाः 3D20E इत्यस्य उच्चटीटरस्य संश्लेषणार्थं विकसिताः सन्ति, यत् पुरुषविशिष्टं परिवर्तितं एक्डाइसोन् अस्ति यत् मादान् अग्रे संभोगं प्रति असंवेदनशीलं कृत्वा मातापितृत्वं आश्वासयति।तस्मिन् एव समये एतेषां मलेरियासञ्चारकानां सक्रियीकरणार्थं कुशलप्रणाली अपि विकसिता अस्ति 3D20E महिलासु पुरुष-विशिष्टस्य EPP.अस्माकं ज्ञाने, कीटेषु अद्वितीयं महत्त्वपूर्णं च कार्यं कुर्वन्तः पुरुष-महिला-प्रधानस्य स्टेरॉयड-हार्मोन-प्रणाल्याः प्रथमं उदाहरणम् अस्ति।पुरुष-विशिष्टं ecdysone कार्यं प्रस्तावितं किन्तु निश्चितरूपेण न प्रदर्शितम्।उदाहरणार्थं, एकः बहुधा असत्यपरिकल्पना 18 अस्ति यत् एतानि कार्याणि द्वारा निष्पादितानि भवितुम् अर्हन्ति 20E पूर्ववर्ती E1.इदं सर्वविदितं यत् ड्रोसोफिलायां मोनाण्ड्री लघुलिंगपेप्टाइड्19,20 यौनस्थापनेन प्रेरिता भवति ये विशिष्टलिंगपेप्टाइडग्राहकद्वारा महिलाप्रजननमार्गं तंत्रिकां कुर्वतां न्यूरॉन्सेन सह अन्तरक्रियां कुर्वन्ति21,22.ए.गैम्बिया मादासु 3D20E द्वारा नियन्त्रितानि अधःप्रवाहसंकेतझरनानि निर्धारयितुं अग्रे कार्यं आवश्यकम् अस्ति तथा च मशकानां ड्रोसोफिला-इत्यस्य च मध्ये एते झरनाः संरक्षितुं शक्यन्ते वा इति निर्धारयितुं ।
अस्माकं अध्ययने चिह्नितानां महिलाप्रजननक्षमतायां व्यवहारे च 3D20E इत्यस्य महत्त्वपूर्णां भूमिकां दृष्ट्वा, 3D20E संश्लेषणं सक्रियीकरणं च प्रति गच्छन्ति मार्गाः भविष्यस्य मशकनियन्त्रणरणनीतयः कृते नूतनान् अवसरान् प्रददति, यथा बाँझकीटप्रौद्योगिकीरणनीतिषु प्रतिस्पर्धीबाँझपुरुषाणां जननम् जंगलीविमोचनार्थं वा कुमारीक्रीडायां 3D20E इत्यस्य अनुकरणार्थं वा उपयोगं कुर्वन्तु।The 3D20E इत्यस्य पुरुषविशिष्टकार्यं तदा विकसितं स्यात् यदा ए.गैम्बिया इत्यादयः सेलियाप्रजातयः स्वस्य वीर्यस्य संभोगप्लगेषु जठरीकरणस्य क्षमताम् अवाप्तवन्तः, यतः एतेन बहूनां हार्मोनानाम् हार्मोन-सक्रिय-एन्जाइमानां च कुशल-स्थानांतरणस्य अनुमतिः भवति ।तथा, मोनाड्री-कार्यन्वयनं कुर्वन् 3D20E-विकासः मादानां कृते (MISO-स्य उच्च-अभिव्यक्ति-माध्यमेन) तेषां अनुकूलतायै एकं तन्त्रं प्रदाति उच्चमलेरियाप्रसारक्षेत्रेषु प्रजननसुष्ठुता, यत् परोक्षरूपेण प्लाज्मोडियमसंक्रमणे योगदानं ददाति।यतोहि दृष्ट्वा यत् महिला 20E इत्यस्य महिला एनोफिलिसमशकेषु पी.फाल्सिपेरमस्य जीवितस्य वृद्धेः च गहनः प्रभावः दर्शितः अस्ति,24 पुरुषः महिला च स्टेरॉयड् हार्मोनमार्गाः अधुना मच्छर-पराजीवी-अन्तर्क्रियाणां प्रमुखाः पक्षाः सन्ति।
A. gambiae G3 उपभेदाः मानककीटस्थितौ (26-28 °C, 65-80% सापेक्षिक आर्द्रता, 12:12 h प्रकाश/अन्धकारप्रकाशकालः) पालिताः आसन्।लार्वा-मत्स्यभोजनं पाउडरयुक्तेन (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets and Tetra Pond Sticks in a ratio of 7:7:2).वयस्कः मच्छराणां कृते एड् लिबिटम १०% डेक्स्ट्रोज घोलः तथा साप्ताहिकं मानवरक्तं (अध्ययनरक्तघटकं) खादितम् आसीत्।सूक्ष्मदर्शनेन अन्तस्य परीक्षणं कृत्वा प्यूपलपदे लिंगं पृथक् कृत्वा कुमारी मशकान् प्राप्तवन्तः।DsRed ट्रांसजीन वहन्तः पुरुषाः पूर्वं वर्णिताः सन्ति।
पूर्वं वर्णितप्रोटोकॉल-अनुसारं बलात् संभोग-प्रयोगाः कृताः ।प्राकृतिक-संभोगार्थं ४-दिवसीय-कन्या-मादाः यौन-परिपक्व-कन्या-पुरुषैः सह १:३ अनुपातेन द्वौ रात्रौ स्थापिताः ।येषु प्रयोगेषु पुरुषान् dsEPP-इत्यनेन सह इन्जेक्शनं दत्तवन्तः, तेषां प्रयोगेषु सह-पञ्जरीकरणं इन्जेक्शन-उत्तर-३-४ दिवसैः सह संयोगेन भवति स्म, यदा फॉस्फेटेज-क्रियाकलापः अधिकतमं मौनम् आसीत् (Extended)। दत्तांशः चित्रम् २ख)।
मशकस्य ऊतकाः, अवशिष्टाः शवः (शरीरस्य शेषभागः), अथवा सम्पूर्णशरीरस्य विच्छेदनं कृत्वा १००% मेथनॉलरूपेण विच्छेदनं कृत्वा एकेन बीडरेन (२ मि.मी.काचस्य मणिः, २,४०० आरपीएम, ९० सेकण्ड्) समरूपीकरणं कृतम् ।उतकस्य मात्राः मेथनॉलस्य आयतनं च निम्नलिखितम् आसीत् : शेषशरीरस्य, १,००० μl मध्ये ५० मैग, 50-100 80 μl; female LRT, 25–50 80 μl.अवक्षेपं मेथनॉलस्य समानमात्रायां द्वितीयं मेथनॉलनिष्कासनं कृतम्।कोशिकीयमलिनतां अपकेन्द्रीकरणद्वारा निष्कासितम्।उभयनिसर्जनात् मेथनॉलं संयोजयित्वा नाइट्रोजनप्रवाहस्य अन्तर्गतं शुष्कं कृतम्, ततः जलस्य 80% मेथनॉलस्य निम्नलिखितमात्रासु पुनः निलम्बितम्: शरीरस्य शेषभागः, 50 μl; MAGs तथा महिला LRT, 30 μl.
नमूनानां विश्लेषणं एलसी-यन्त्रेण (Vanquish, Thermo Fisher) इत्यनेन सह युग्मितेन मास-स्पेक्ट्रोमीटर् (ID-X, Thermo Fisher) इत्यनेन कृतम् ।5 μl नमूना 25 °C इत्यत्र निर्वाहितस्य 3 μm, 100 × 4.6 mm स्तम्भस्य (Inspire C8, Dikma) इत्यस्य उपरि इन्जेक्शनं कृतम् ।LC कृते चलचरणाः A (जलं, 0.1%) आसन् । formic acid) and B (acetonitrile, 0.1% formic acid).LC ढाल निम्नलिखितरूपेण आसीत्: 5% B 1 मिनटपर्यन्तं, ततः 11 मिनट् यावत् 100% B यावत् वर्धितः।100% पर 8 मिनटस्य अनन्तरं, 5% B इत्यत्र 4 मिनट् यावत् स्तम्भस्य पुनः संतुलनं कुर्वन्तु।प्रवाहस्य दरः 0.3 ml आसीत् min-1.MS स्रोते Ionization is सकारात्मक-नकारात्मक-गुणेषु तापित-विद्युत्स्प्रे-आयनीकरणेन सिद्धम् ।
मास स्पेक्ट्रोमीटर् पूर्ण MS मोड् मध्ये 60,000 रिजोल्यूशनेन 350 तः 680 पर्यन्तं m/z श्रेण्यां आँकडानां मापनं करोति।MS/MS आँकडा [M + H]+ (सर्व लक्ष्य), [M - H2O + H]+ (सर्व लक्ष्य), तथा [M - H]- (फॉस्फोरिलेशन लक्ष्य) इत्यत्र अधिग्रहीताः आसन्।MS/MS आँकडानां उपयोगः लक्ष्याणां ecdysone गुणानाम् पुष्ट्यर्थं कृतः यस्य कृते कोऽपि मानकः नासीत् उपलब्धः आसीत्।गैर-लक्षित ecdysteroids इत्यस्य पहिचानाय >15% सापेक्षिकप्रचुरतायुक्तानां सर्वेषां HPLC शिखरानाम् MS/MS आँकडानां विश्लेषणं कृतम्।एकस्मिन् पुरुषे प्राप्तराशिषु तेषां समतुल्यतायाः गणनां कर्तुं शुद्धमानकानां (20E, 3D20E) निरपेक्षमात्राणां वा पतलापनानां गणनाय शुद्धमानकानां (20E, 3D20E) उपयोगेन परिमाणं निर्धारयन्तु।For 3D20E, मात्रानिर्धारणं निम्नलिखित एड्यूक्ट् इत्यस्य योगस्य उपयोगेन कृतम्: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Tracefinder (संस्करण 4.1) इत्यस्य उपयोगेन आँकडान् निष्कास्य परिमाणं कृतम्।MS/MS आँकडानां विश्लेषणं Xcalibur (संस्करण 4.4) इत्यस्य उपयोगेन कृतम्।E, 20E इत्यस्य MS स्पेक्ट्रा तथा 3D20E इत्यस्य तुलना तत्तत् मानकैः सह कृता।3D20E22P इत्यस्य विश्लेषणं गिरार्डस्य अभिकर्मकेण सह व्युत्पन्नीकरणेन कृतम्।20E22P इत्यस्य विश्लेषणं m/z अनुपातेन कृतम्।
3D20E22P MAG.तः शुद्धं कृतम् आसीत्।शुद्धिकरणं एचपीएलसी-MS/MS विश्लेषणस्य समाने LC परिस्थितिषु चतुर्ध्रुवीय द्रव्यमान-आधारित-डिटेक्टर (QDa, Acquity, Waters) इत्यनेन सह अति-प्रदर्शन-तरल-क्रोमैटोग्राफ (Acquity, Waters) इत्यस्य उपयोगेन विश्लेषणात्मक-परिमाणे कृतम् आसीत्।अंश-संग्रहणं तदा ट्रिगरं कृतम् यदा 3D20E22P इत्यस्य अनुरूपं m/z आसीत् was detected at the same retention time as previously determined.ततः निष्कासितानां यौगिकानां शुद्धतायाः जाँचः HPLC-MS/MS द्वारा उपरि वर्णितरीत्या कृता।
निर्माता निर्देशानुसारं TRI अभिकर्मक (Thermo Fisher) इत्यस्य उपयोगेन 10-12 प्रजनन ऊतकेभ्यः अथवा शरीरस्य अन्येभ्यः भागेभ्यः (शिरःहीनेभ्यः) कुल आरएनए निष्कासितम्।RNA इत्यस्य उपचारः TURBO DNase (Thermo Fisher) इत्यनेन कृतः।cDNA इत्यस्य संश्लेषणं तदनन्तरं Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) इत्यस्य उपयोगेन कृतम् manufacturer's instructions.रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) कृते प्राइमराः पूर्वं प्रकाशिताः आसन्24 अथवा Primer-BLAST26 इत्यस्य उपयोगेन डिजाइनं कृतवन्तः, यत्र 70-150 bp आकारस्य उत्पादानाम् प्राधान्यं दत्तं भवति तथा च exon-exon junctions अथवा Primer pair primers separate exons.cDNA samples from three to four bioological replicates RT-qPCR कृते जलस्य चतुर्गुणं पतलाः कृताः आसन्।मात्राकरणं 15 μl प्रतिकृतिप्रतिक्रियासु कृतम् यस्मिन् 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), प्राइमर, तथा 5 μl पतला cDNA आसीत्।प्रतिक्रियाः QuantStudio 6 Pro वास्तविकसमय PCR प्रणाली (Thermo Fisher) इत्यत्र चालिताः आसन् तथा च Design and विश्लेषणं (संस्करणं 2.4.3).यथा अस्मिन् अध्ययने प्रदर्शितं, सापेक्षिकमात्रायां राइबोसोमलजीन RpL19 (AGAP004422) प्रति सामान्यीकृता, यस्य अभिव्यक्तिः रक्तभोजनेन 27 अथवा संभोगेन 3 इत्यनेन महत्त्वपूर्णरूपेण परिवर्तनं न कृतवान्
आरएनए गुणवत्तायाः जाँच एजिलेण्ट् बायोएनालाइजर 2100 बायोएनालाइजर (एजिलेण्ट्) इत्यस्य उपयोगेन कृता आसीत्।इलुमिना युग्मित-अन्त-पुस्तकालयाः MIT तथा हार्वर्डस्य ब्रॉड इन्स्टिट्यूट् इत्यत्र तैयाराः चालिताः च आसन्।अनुक्रमण-पठनानि पूर्वनिर्धारित-पैरामीटर्-सहितं HISAT2 (संस्करणं 2.0.5) इत्यस्य उपयोगेन A. gambiae जीनोम (PEST तनाव, संस्करणं 4.12) इत्यस्य उपयोगेन संरेखितानि आसन्।मैपिंगगुणवत्तायाः सह पठन्ति (MAPQ) स्कोर <30 Samtools (संस्करण 1.3.1) इत्यस्य उपयोगेन निष्कासितम्।जीनेषु मैप् कृतानां पठनानां संख्यां पूर्वनिर्धारितमापदण्डैः सह htseq-count (संस्करणं 0.9.1) इत्यस्य उपयोगेन गणना कृता।सामान्यीकृतपठनगणनायाः गणना कृता तथा च R (संस्करण 4.0.3) इत्यस्मिन् DESeq2 संकुलस्य (संस्करणं 1.28.1) इत्यस्य उपयोगेन विभेदकजीनव्यञ्जनस्य विश्लेषणं कृतम्।
Ecdysone-संशोधक जीन उम्मीदवारानाम् पहिचानः प्रथमं PSI-BLAST एल्गोरिदम् (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) इत्यस्य उपयोगेन A. gambiae जीनोमस्य अन्वेषणेन कृतम्, पूर्वनिर्धारितमूल्यानां उपयोगेन निम्नलिखितप्रश्नप्रोटीन अनुक्रमैः सह पैरामीटर्स्: Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (अभिगमन संख्या XP_005182020.1, XP_005175332.1 तथा XP_011294434.1) तथा Microplitis विध्वंसक (अभिगमन संख्या XP_008552646.1 तथा XP_008552645.1)। B. mori (अभिगमन संख्या NP_001036900), Drosophila melanogaster (अभिगमन संख्या NP_651202), Apis mellifera (अभिगमन संख्या XP_394838) तथा Acyrthosiphon pisum (अभिगमन संख्या XP_001947166) से EcK; तथा EPP B. mori (Accession No. XP_001947166) NP_001177919.1 तथा NP_001243996.1) तथा D. melanogaster (Accession No. NP_572986.1) (चरण 1) के EO तः EPP।अनन्तरं, उच्च mRNA अभिव्यक्ति (>100) आधारित फ़िल्टर हिट गाम्बियादेशे प्रजनन ऊतकयोः (महिला LRT अथवा MAG) प्रति मिलियनं मैप्ड् रीड्स् (FPKM) अथवा >85%) खण्डाः/किलोबेज एक्सोन्स् (चरणम् 2) । विशिष्टतायां सुधारं कर्तुं वयं उम्मीदवार एन्जाइम्स् चयनं कृतवन्तः ये ए.अल्बिमैनसस्य प्रजनन ऊतकयोः अपि अभिव्यक्ताः भवन्ति, एकः एनोफिल्स् प्रजातिः यः संभोगस्य समये एक्डाइसोनस्य संश्लेषणं वा स्थानान्तरणं वा न करोति।अभ्यर्थी जीनानां ए.अल्बिमैनस प्रजनन ऊतक (चरण 3) इत्यस्मिन् न्यून अभिव्यक्ति (<100 FPKM अथवा <85th percentile) इत्यस्य आधारेण छाननं कृतम्।As a final filter (step 4), अभ्यर्थी जीनानां निम्नलिखितयोः न्यूनातिन्यूनम् एकं संतुष्टं कर्तुं आवश्यकता वर्तते: (1) विभेदकरूपेण अभिव्यक्तजीनानां विश्लेषणस्य अनुसारं संभोगस्य अनन्तरं महत्त्वपूर्णतया अप-रेगुलेटेड (P < 0.05) तथा (2) गैर-प्रजनन ऊतकयोः (< 85 % अथवा <100 FPKM)।
वयं पूर्वं वर्णितविधयः 28,29,30 संशोधितवन्तः येन सम्पूर्णजीवसमस्थानिकलेबलिंगं प्राप्तुं शक्यते।संक्षेपेण, जंगलीप्रकारस्य Saccharomyces cerevisiae प्रकार II (YSC2, Sigma) इत्यस्य परीक्षणं खमीरनाइट्रोजन आधारे (BD Difco, DF0335) युक्ते (wt/vol) 2% ग्लूकोज (G7528, Sigma), 1.7% युक्ते कृतम् आसीत्। अमीनो अम्लरहितं अमोनियमसल्फेटं च । culture medium) तथा 5% 15N amonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) नाइट्रोजनस्य एकमात्रस्रोतरूपेण।खमीरं अपकेन्द्रीकरणेन पुनः प्राप्तं तथा च मच्छरलार्वा प्यूपेशनपर्यन्तं एड् लिबिटम भोजनं दत्तम्।चतुर्थस्य इन्स्टारस्य निवारणाय मत्स्यपिष्टेन (0.5 mg प्रति 300 लार्वा) पूरकम् mortality.ततः संभोगस्य समये स्थानान्तरितस्य पुरुषप्रोटीओमस्य विश्लेषणार्थं अलेबलयुक्तैः पुरुषैः सह संभोगप्रयोगेषु केवलं मादाः एव उपयुज्यन्ते स्म ।
4-6 दिवसीय 15N-टैग्ड् कुमारी मादाः आयुः-मेलित-अटैग-कृत-कुमारी-पुरुषैः सह संभोगं कर्तुं बाध्यन्ते स्म।एपिफ्लोरोसेन्स-सूक्ष्मदर्शिकायाः ​​अन्तर्गतं संभोग-प्लगस्य पत्ताङ्गीकरणेन सफल-संभोगस्य सत्यापनम् अभवत्।3, 12, तथा 24 hpm-समये 45-55 संभोग-मादानां अलिन्दानां विच्छेदनं 50 μl अमोनियम-रूपेण कृतम् बाइकार्बोनेट बफर (pH 7.8) कृत्वा मूसलेन समरूपीकृतम्।समरूपं अपकेन्द्रीकृत्य सुपरनेटेंटं 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट् इत्यस्मिन् 50 μl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) इत्यनेन सह मिश्रितम्।प्रत्येकस्य नमूनातः सुपरनेटेंटं गोलीं च शुष्कहिमस्य उपरि स्नैप फ्रॉज् कृत्वा रात्रौ यावत् प्रेषितम् वाशिंगटन विश्वविद्यालये MacCoss प्रयोगशाला, यत्र LC-MS/MS कृते नमूनानिर्माणं सम्पन्नम् आसीत्।गोलीं 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट् मध्ये 0.1% RapiGest इत्यस्य 50 μl मध्ये पुनः निलम्बयन्तु तथा जलस्नाने sonicate कुर्वन्तु।गोलीया: सुपरनेटेन्टस्य च प्रोटीनसान्द्रतां BCA परीक्षणेन मापिता, नमूनानां 5 mM dithiothreitol इत्यनेन न्यूनीकरणं कृतम् (DTT; Sigma), 15 mM iodoacetamide (Sigma) इत्यनेन सह अल्काइलीकृत्य 37 °C (1:0 50) इत्यत्र 1 घण्टापर्यन्तं ट्रिप्सिनीकरणेन सह इन्क्यूबेशनं कृतम्: tripsin:substrate ratio).RapiGest इत्यस्य 200 mM HCl इत्यस्य योजनेन लाइज् कृतम्, तदनन्तरं 37 °C इत्यत्र 45 मिनट् यावत् इन्क्यूबेशनं कृत्वा 14,000 आरपीएम 10 मिनिट् यावत् 4 °C पर मलबे दूरीकर्तुं।नमूनानां द्वय-मोड ठोस-चरण-निष्कासनेन (Oasis MCX cartridges, Waters) प्रक्षालितम् आसीत् तथा च 0.33 μg μl-1 इत्यस्य अन्तिम-प्रोटीन-सान्द्रतायाः कृते 0.1% फॉर्मिक-अम्ले पुनः निलम्बितं कृतम्।अलेबल-युक्तानां MAG प्रोटीओमानां कुमारीतः समानरूपेण विश्लेषणं कृतम् males.प्रत्येकस्य नमूनायाः कृते द्वौ विश्लेषणात्मकप्रतिकृतौ विश्लेषितौ।अनन्तरं बृहस्पति C12 उल्टा-चरण-राल (Phenomenex) तथा 180-मिनिटस्य तरल-क्रोमैटोग्राफी-सहितं 4-cm फ्यूज्ड-सिलिका Kasil1 (PQ) frit trap इत्यनेन सह 25-cm फ्यूज्ड सिलिका 75-μm स्तम्भस्य उपयोगेन प्रत्येकस्य 1 μg विश्लेषणं कृतम्। नमूना पाचकाः – MS/MS इत्येतत् Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) इत्यनेन nanoACQUITY UPLC System (Waters) इत्यनेन सह चालितम् आसीत् ।प्रत्येकं रन कृते उत्पन्नं डेटा-सम्बद्धं अधिग्रहणदत्तांशं Proteowizard (संस्करणं 3.0.20287) इत्यस्य उपयोगेन mzML प्रारूपे परिवर्तितं तथा च प्रोटीनयुक्तस्य FASTA आँकडाधारस्य विरुद्धं Comet31 (संस्करणं 3.2) इत्यस्य उपयोगेन sequences from Anopheles gambiae (VectorBase version 54), Anopheles coluzzi Mali-NIH (VectorBase version 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, March 2021), A. gambiae RNA-seq, तथा ज्ञातमानवदूषकाणां त्रि-फ्रेम-अनुवादानाम् उपरि अन्वेषणं कृतम्।Peptide map-matched FDRs इत्यस्य उपयोगेन निर्धारितम् Percolator32 (संस्करण 3.05) 0.01 सीमा सह, तथा च पेप्टाइड्स Limelight33 (संस्करण 2.2.0) इत्यस्मिन् प्रोटीनपार्सिमोनी इत्यस्य उपयोगेन प्रोटीनपरिचयरूपेण एकत्रिताः आसन्।पूर्वं वर्णितरूपेण प्रत्येकस्मिन् रनस्य प्रत्येकस्य प्रोटीनस्य कृते गणितस्य सामान्यीकृतवर्णक्रमीयप्रचुरताकारकस्य (NSAF) उपयोगेन सापेक्षिकप्रोटीनप्रचुरतायां अनुमानितम्।प्रत्येकप्रोटीनस्य सापेक्षतया NSAF इत्यस्य औसतं द्वयोः भिन्नजैविकयोः नमूनानां पारं कृतम् replicates.15N लेबलिंग् सफलतया महिला प्रोटीओमस्य मुखौटां कृतवान्, यद्यपि लेबलकृतानां कुमारीभ्यः अल्पमात्रायां अलेबलकृतप्रोटीनस्य पत्ताङ्गीकरणं कर्तुं शक्यते स्म।अस्माभिः महिलाकच्चेषु नमूनासु केवलं तकनीकीधावनेषु पुरुषप्रोटीनकमीकरणस्य (1-5 स्पेक्ट्रा) पत्ताङ्गीकरणं अभिलेखितं, यत्र कच्चा नमूनाः पुरुष/संभोगनमूनानां पश्चात् चालिताः आसन्, HPLC “carry over” इत्यस्य परिणामेण लेबलकृतकन्यानां 'दूषकाः' पूरकसारणी १ मध्ये सूचीबद्धाः सन्ति ।
द्वे एंटीजेनिक पेप्टाइड्, QTTDRVAPAPDQQQ (आइसोटाइप PA इत्यस्य अन्तः) तथा MESDGTTPSGDSEQ (समप्रकार PA तथा PB इत्यस्य अन्तः) Genscript इत्यस्मिन्।द्वयोः पेप्टाइडयोः संयोजनं कृतम्, ततः वाहकप्रोटीन KLH इत्यनेन सह संयुग्मितं कृत्वा न्यूजीलैण्डस्य खरगोशेषु इन्जेक्शनं कृतम्।चतुर्थस्य इन्जेक्शनस्य अनन्तरं खरगोशानां बलिदानं कृतम्, तथा च कुल IgG इत्यस्य बलिदानं आत्मीयताद्वारा कृतम् purification.अधिकतम EPP-विशिष्टस्य शशस्य IgG इत्यस्य उपयोगः अग्रे वेस्टर्न ब्लॉटिंग् कृते कृतः।
वेस्टर्न ब्लॉट् कृते, MAG (n = 10, यत्र n जैविकरूपेण स्वतन्त्रस्य मशकस्य नमूनानां संख्यां प्रतिनिधियति) तथा च महिला LRT (n = 30) 4-दिनस्य कुमारी पुरुषाणां तथा कुमारी अथवा बल-संभोगस्य महिलानां (<10 संभोगोत्तर), प्रोटीन निष्कर्षण बफर (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25%) इत्येतयोः कृते, प्रोटीननिष्कासनबफरः (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% सोडियम डिऑक्सीकोलेट;150 mM NaCl;1 mM EDTA; °C.प्रोटीनानां परिमाणं ब्रैडफोर्डपरीक्षणेन (Bio-Rad) कृतम्।ततः, 20 μg MAG प्रोटीन, 40 μg LRT प्रोटीन, तथा 20 μg अवशिष्टबल्क प्रोटीनस्य विकृतीकरणं कृत्वा MOPS बफरस्य उपयोगेन 10% Bis-Tris NuPAGE द्वारा पृथक् कृतम्।प्रोटीनानि iBlot2 स्थानान्तरणस्य उपयोगेन polyvinylidene fluoride झिल्लीषु स्थानान्तरितानि system (Thermo Fisher).झिल्लीं 1× PBS-T (PBS मध्ये 0.1% Tween-20) इत्यस्मिन् द्विवारं प्रक्षाल्य ततः Odyssey blocking buffer (Li-Cor) इत्यस्मिन् 22°C इत्यत्र 1 घण्टां यावत् अवरुद्धं कृतम्।झिल्लीं कस्टम् खरगोश-एण्टी-EPP polyclonal primary antibody (blocking buffer इत्यस्मिन् 1:700) इत्यनेन सह 4 °C इत्यत्र रात्रौ यावत् हिलायाम् एण्टी-एक्टिन मोनोक्लोनल प्राथमिक प्रतिपिण्ड MAC237 (Abeam; 1:4,000)।झिल्लीं PBS-T इत्यनेन प्रक्षाल्य ततः 0.01% SDS तथा 0.2% युक्ते अवरोधकबफरे द्वितीयकप्रतिपिण्डैः (गधाविरोधी खरगोशः 800CW तथा बकरी चूहाविरोधी 680LT (Li-Cor), द्वौ अपि 1:20,000) इन्क्यूबेशनं कृतम्। Tween -20 22 °C इत्यत्र 1 घण्टां यावत्।झिल्लीं PBS-T इत्यनेन प्रक्षाल्य Odyssey CLx scanner इत्यनेन इमेजिंगं कृतम्।इमेज स्टूडियो (संस्करण 5.2) इत्यत्र चित्राणि एकत्रितानि संसाधितानि च।EPP-RA समरूपस्य (82 kDa) अनुरूपं विशिष्टं पट्टिकां न ज्ञातम्।
EPP (histidine phosphatase domain, NCBI conserved domain search 34 युक्त आइसोफॉर्म AGAP002463-RB इत्यस्य रूपेण) तथा EcK2 (AGAP002181) इत्यस्य कोडिंग क्षेत्रं pET-21a(+) प्लाज्मिड् (Novagen Millipore Sigma) इत्यस्मिन् क्लोनीकृतम् प्राइमर् विस्तारितदत्तांशसारणी 2.अष्टौ GS4 लिङ्कर् (सहयोगेन) pET-21a(+)-EcK2 निर्माणस्य C-टर्मिनल 6xHis टैगस्य पूर्वं सम्मिलिताः आसन्।पुनर्संयोजकप्रोटीनानां उत्पादनं NEBExpress कोशिका-मुक्त E. coli प्रोटीनसंश्लेषणप्रतिक्रिया (New England BioLabs) इत्यस्य उपयोगेन कृतम् आसीत्।पुनर्संयोजकप्रोटीनानां NEBExpress Ni spins स्तम्भानां उपयोगेन शुद्धीकरणं कृतम् (New England BioLabs).NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit इत्यस्मात् DNA टेम्पलेट् इत्यस्य उपयोगेन Dihydrofolate reductase (DHFR) नियन्त्रणप्रोटीनस्य उत्पादनं कृतम्।प्रोटीनानि PBS इत्यस्मिन् 50% ग्लिसरॉलमध्ये -20 °C इत्यत्र 3 मासपर्यन्तं संग्रहीताः आसन्।
ईपीपी तथा ऊतक अर्कस्य फॉस्फेटेज गतिविधिः 4-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (pNPP; Sigma-Aldrich) इत्यस्य उपयोगेन मापिता।प्रतिक्रियाबफरस्य 25 mM Tris, 50 mM एसिटिक अम्ल, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, तथा 1 mM DTT इति प्रतिक्रिया बफरमध्ये ऊतकस्य होमोजेनाइजेशनं कृतम् तथा कोशिकामलिनतां अपकेन्द्रीकरणद्वारा निष्कासितम्।2.5 mg ml-1 pNPP युक्ते प्रतिक्रियाबफरमध्ये एन्जाइम अथवा ऊतकसारं योजयित्वा प्रतिक्रियां आरभत।प्रतिक्रियामिश्रणं कक्षतापमाने अन्धकारे इन्क्यूबेशनं कृतम्, तथा च pNPP तः परिवर्तितस्य pNP इत्यस्य मात्रां विभिन्नसमये 405 nm इत्यत्र अवशोषणं मापयित्वा परिमाणं कृतम्।
इन विट्रो EcK क्रियाकलापस्य कृते प्रोटीनं 0.2 mg 20E अथवा 3D20E इत्यनेन सह 200 μl बफर (pH 7.5) इत्यस्मिन् 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP तथा 10 mM MgCl2 युक्ते 27 °C इत्यत्र 2 घण्टां यावत् इन्क्यूबेशनं कृतम् ।प्रतिक्रिया 800 योजयित्वा स्थगितम् μl मेथनॉल, ततः -20 °C मध्ये 1 घण्टां यावत् शीतलं कृतम्, ततः 20,000 g मध्ये 4 °C मध्ये 10 मिनिट् यावत् अपकेन्द्रीकरणं कृतम्।ततः सुपरनेटेंटस्य विश्लेषणं HPLC-MS/MS द्वारा कृतम्।नियन्त्रणसमूहे प्रयुक्तानां प्रोटीनानां ताप-निष्क्रियीकरणार्थं प्रोटीनानां 95°C मध्ये PBS मध्ये 50% ग्लिसरॉल् मध्ये 20 मिनिट् यावत् इन्क्यूबेट् कृतम्।
इन विट्रो EPP क्रियाकलापस्य कृते प्रोटीनं 25 mM Tris, 50 mM एसिटिक अम्लम्, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, तथा 1 mM DTT 27 °C इत्यत्र 3 घण्टाः यावत्।400 μl मेथनॉलं योजयित्वा प्रतिक्रियां स्थगितम् अभवत् तथा च -20 °C इत्यत्र 1 घण्टां यावत् शीतलं कृतम्, ततः 20,000 g इत्यत्र 4 °C इत्यत्र 10 निमेषपर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणं कृतम्।उपयुक्तं HPLC-MS/MS द्वारा विश्लेषितम्।
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) तथा EcK2 (556 bp) इत्येतयोः कृते PCR-खण्डान् मिश्रित-लिंग-शिरः-रहित-मशक-शवेभ्यः निर्मितेन cDNA-तः प्रवर्धितवन्तः ।eGFP-नियन्त्रणस्य (495 bp) PCR-खण्डं पूर्वं वर्णित-pCR2.1-eGFP-तः प्रवर्धितम् पीसीआर प्राइमर् विस्तारितदत्तांशसारणी 2.पीसीआर-खण्डं pL4440 प्लाज्मिड्-उल्टा-T7-प्रोमोटर-मध्ये सम्मिलितम् आसीत् ।प्लाज्मिड्-निर्माणं NEB 5-α सक्षम-ई.कोलाई (न्यू इङ्ग्लैण्ड बायोलैब्स्) तः बरामदं कृत्वा उपयोगात् पूर्वं DNA-अनुक्रमणेन सत्यापितं (प्रवेश-अनुक्रमस्य कृते पूरक-आँकडा 1 पश्यन्तु) (विस्तारितदत्तांशसारणी 2) इत्यस्य उपयोगः pL4440-आधारितप्लाज्मिडतः इन्सर्टस्य प्रवर्धनार्थं कृतः।PCR उत्पादस्य आकारस्य पुष्टिः अगरोज जेल वैद्युतकणसंचलनेन कृता।dsRNA इत्यस्य मेगास्क्रिप्ट् T7 प्रतिलेखन किट (Thermo Fisher) इत्यस्य उपयोगेन पीसीआर टेम्पलेट् तः प्रतिलेखनं कृतम् आसीत् तथा च पूर्वं वर्णितसंशोधनैः सह निर्मातुः निर्देशानुसारं शुद्धं कृतम्।
dsRNA इन्जेक्शनस्य कृते, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ng nl-1 सान्द्रतायां वयस्कपुरुषाणां वा महिलानां (Nanoject III, Drummond) वक्षःस्थले एक्लोजनस्य अनन्तरं 1 दिवसस्य अन्तः इन्जेक्शनं कृतम्।आरएनए द्वारा न्यूनातिन्यूनं त्रीणि जैविकप्रतिकृतयः जीननॉकडाउनस्तरः निर्धारितः extraction, cDNA synthesis, and RT-qPCR.ecdysone injection कृते 4 दिवसीय कुमारी अथवा 6 दिवसीय कुमारी रक्तपोषित महिलाओं 0.13, 0.21, अथवा 0.63 μg 20E अथवा 3D20E (Nanoject III, Drummond) 1.3, 2.1, सान्द्रतायां इन्जेक्शनं कृतम्। क्रमशः प्रयोगात्मकपरिकल्पनायाः आधारेण अथवा 6.3 ng nl-1.जले 100 nl 10% (vol/vol) इथेनॉलस्य इन्जेक्शनं कुर्वन्तु; 100 nl 3D20E22P 10% इथेनॉल (MAGs युग्मे प्राप्तस्य मात्रायाः 75% बराबरम्)।मशकान् यादृच्छिकरूपेण इन्जेक्शनसमूहे नियुक्ताः आसन्।
स्पॉनिंग परीक्षणार्थं ३ दिवसीयानां मादानां कृते मानवरक्तस्य इच्छानुसारं भोजनं कृतम् आसीत् ।आंशिकरूपेण पोषितान् अथवा अपोषितान् मशकान् निष्कासयन्तु।उपचारस्य आधारेण मादाः रक्तभोजनस्य न्यूनातिन्यूनं ४८ घण्टानां अनन्तरं चतुर्रात्रौ पृथक् पृथक् स्पॉनिंगकपेषु स्थापिताः आसन्।अण्डानां गणना स्टीरियोस्कोपेन (Stemi 508, Zeiss) कृता संभोगकृतानां स्त्रियाः कृते लार्वारूपेण उत्सर्जिताः अण्डाः उर्वराः इति मन्यन्ते स्म ।
संभोगपरीक्षणस्य कृते, मादाः संभोगप्रतिरोधं विकसितुं उपचारानुसारं न्यूनातिन्यूनं २ दिवसान् अनुमताः आसन्, तदनन्तरं वन्यप्रकारस्य आयुः-मेलितपुरुषान् एकस्मिन् एव पञ्जरे प्रविष्टाः आसन्।द्वयोः रात्रयोः अनन्तरं, मादा निषेचितपुटिकाः विच्छेदनं कृत्वा जीनोमिक डीएनए 10 mM Tris-HCl, युक्ते बफरमध्ये फ्रीज-पिघलने, सोनिकेशनेन च मुक्तं कृतम् 1 mM EDTA, and 25 mM NaCl (pH 8.2).नमूनान् Proteinase K (0.86 μg μl-1) इत्यनेन सह 55 °C इत्यत्र 15 मिनिट् यावत्, तदनन्तरं 95 °C इत्यत्र 10 मिनिट् यावत् इन्क्यूबेशनं कृतम्।कच्चा जीनोमिक DNA तैयारीः 10-गुणाः पतलाः कृत्वा Y गुणसूत्र-अनुक्रमस्य qPCR-परिचयस्य अधीनाः आसन्; primers are listed in Extended Data Table 2.Y गुणसूत्र अनुक्रमस्य अभावः संभोगं न भवति इति सूचयति।
पुनः संभोगपरीक्षणार्थं बलात् संभोगयुक्तानां मादानां संभोगस्य स्थितिं पुष्टयितुं संभोगप्लगस्य उपस्थितेः परीक्षणं कृतम् तथा च पुरुषाणां अभावे संभोगस्य प्रतिरोधकशक्तिं विकसितुं २ दिवसानां अनुमतिः दत्ता, यथा पूर्वं वर्णितम् 36 .DsRed ट्रांसजेनिक शुक्राणुं वहन्तः पुरुषाः ततः मादापञ्जरेषु प्रविष्टाः आसन्।ततः द्वयोः रात्रयोः अनन्तरं निषेचनपुटिकाः प्रविष्टाः आसन् मादाभ्यः विच्छेदनं कृत्वा, उपरि वर्णितरीत्या जीनोमिक-डीएनए-निर्माणं कृत्वा DsRed-ट्रांसजीनस्य qPCR-परिचयस्य अधीनं कृतम्; primers are listed in Extended Data Table 2.DsRed ट्रांसजीनस्य अभावेन सूचितं यत् पुनः संभोगः न अभवत्।
3D20E पूर्वं वर्णितं यथा संश्लेषितम् 37 .संक्षेपेण, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) 10 ml जले विलीनं कृतम्, तदनन्तरं 30 mg प्लैटिनम कृष्णं (चूर्णरूपेण, Sigma-Aldrich) योजितम् temperature.6 घण्टानां अनन्तरं प्रतिक्रियां स्थगयितुं 30 mL मेथनॉलं योजितम्।उत्प्रेरककणान् दूरीकर्तुं मिश्रणं अपकेन्द्रीकृतं कृतम्।सुपरनेटेंटं कक्षतापमाने वैक्यूममध्ये शुष्कतापर्यन्तं वाष्पीकरणं कृतम्।शुष्कप्रतिक्रियाउत्पादं HPLC-MS/MS विश्लेषणार्थं इन्जेक्शनार्थं 10% इथेनॉल तथा मेथनॉलमध्ये विलीनं कृतम्।रूपान्तरणस्य दरं (20E तः 3D20E) प्रायः 97% (चित्र 4b) आसीत्, संश्लेषितस्य 3D20E इत्यस्य MS स्पेक्ट्रमः संभोगकृतमादासु (चित्र 4c) दृश्यमानस्य स्पेक्ट्रमस्य मेलनं कृतवान्
किंवदंतीयां कृतानां सांख्यिकीयपरीक्षाणां विशिष्टविवरणं भवति।GraphPad (संस्करणं 9.0) इत्यस्य उपयोगः Fisher इत्यस्य सटीकपरीक्षणं, Mantel-Cox परीक्षणं, Student इत्यस्य t-test च कर्तुं कृतः।Cochran-Mantel-Haenszel परीक्षणं कस्टम् R स्क्रिप्ट् (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test इत्यत्र उपलभ्यते) इत्यस्य उपयोगेन कृतम् आसीत्।दत्तांशवितरणस्य परीक्षणं कृतम् आसीत् normality using the Shapiro-Wilk test with a significance threshold of 0.05.यदा आँकडा सामान्यता परीक्षणं विफलं जातम्, तदा Mann-Whitney परीक्षणं कृतम्।Mantel-Cox test.A सर्वेषां परीक्षणानां कृते P = 0.05 इत्यस्य महत्त्वमूल्यं सीमारूपेण उपयुज्यते स्म ।
अध्ययनस्य परिकल्पनायाः विषये अधिकाधिकजानकारीं प्राप्तुं अस्मिन् लेखे सम्बद्धं प्रकृतिसंशोधनप्रतिवेदनस्य सारं पश्यन्तु ।
MS प्रोटीओमिक-आँकडाः PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) इत्यस्य माध्यमेन ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) इत्यस्मिन् आँकडा-समूह-परिचय-कर्ता PXD032157 इत्यनेन सह निक्षेपितः
आरएनए-seq डाटासेट् जीन एक्सप्रेशन कम्प्रीहेंसिव लाइब्रेरी (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) इत्यस्मिन् सीरियल रिकार्ड GSE198665 इत्यस्य अन्तर्गतं निक्षिप्तः अस्ति ।
वर्तमान अध्ययनस्य समये उत्पन्नाः/अथवा विश्लेषिताः अतिरिक्तदत्तांशसमूहाः उचितानुरोधेन तत्सम्बद्धलेखकानां कृते प्राप्तुं शक्यन्ते।अस्मिन् लेखे स्रोतदत्तांशः प्रदत्तः अस्ति।
डी लूफ, ए Ecdysteroids: उपेक्षित कीट सेक्स स्टेरॉयड?पुरुष: ब्लैक बॉक्स.कीट विज्ञान.13, 325-338 (2006).
रेडफर्न्, सीपीएफ २०-हाइड्रोक्सीएक्डाइसोन् तथा एनोफिलिस स्टेफेन्स् इत्यस्मिन् अण्डकोषस्य विकासः।जे. कीट शरीर क्रिया विज्ञान.28, 97-109 (1982).