कोशिकाविभागीकरणं होमियोस्टेसिसं च निर्वाहयितुम् स्रावमार्गे प्रोटीनस्य क्रमणं अत्यावश्यकम् अस्ति । शंख-मध्यस्थ-क्रमणस्य अतिरिक्तं स्राव-परिवहन-प्रक्रियायां किनेसिन्-क्रमणिकायां लिपिडस्य भूमिका दीर्घकालीनः मूलभूतः प्रश्नः अस्ति यस्य उत्तरम् अद्यापि न प्राप्तम् अत्र, वयं 3D एकत्रितबहुरङ्ग-उच्च-संकल्प-वास्तविक-समय-प्रतिबिम्बनं कुर्मः यत् विवो-मध्ये सिद्धं कुर्मः यत् अत्यन्तं दीर्घ-सेरामाइड-लिपिड-अंशैः सह नवसंश्लेषित-ग्लाइकोसाइलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल्-स्थिर-प्रोटीन-समूहः विशेष-अन्तःप्लाज्मेषु वर्गीकृतः भवति नेट-निर्गम-स्थलः, यत् ट्रांसमेम्ब्रेन-प्रोटीनैः उपयुज्यमानात् भिन्नम् अस्ति तदतिरिक्तं वयं दर्शयामः यत् अन्तःप्लाज्मिकजालझिल्लीयां सेरामाइडस्य श्रृङ्खलादीर्घता अस्य क्रमणचयनात्मकतायाः कृते महत्त्वपूर्णा अस्ति । अस्माकं अध्ययनं स्रावमार्गे चयनात्मकनिर्यातस्थलेषु लिपिडशृङ्खलादीर्घतायाः आधारेण प्रोटीनमालस्य वर्गीकरणाय प्रथमं प्रत्यक्षं विवो प्रमाणं प्रदाति।
ततः यूकेरियोटिककोशिकासु अन्तःप्लाज्मिकजालपुटे (ER) संश्लेषितप्रोटीनानां समुचितकोशिकीयगन्तव्यस्थानं प्रति प्रसवार्थं स्रावमार्गेण परिवहनकाले क्रमणं क्रियते (1) कोट-मध्यस्थ-क्रमणस्य अतिरिक्तं, दीर्घकालं यावत् अनुमानं कृतम् आसीत् यत् कतिपय-लिपिडाः विशिष्ट-प्रोटीन-विशिष्ट-झिल्ली-क्षेत्रेषु समूहीकृत्य चयनात्मक-निर्गम-बिन्दुरूपेण अपि कार्यं कर्तुं शक्नुवन्ति (2-5) परन्तु अद्यापि एतत् सम्भाव्यं लिपिड्-आधारितं तन्त्रं सिद्धयितुं प्रत्यक्ष-इन् विवो-साक्ष्यस्य अभावः अस्ति । एतस्याः मूलभूतसमस्यायाः समाधानार्थं वयं खमीरे अध्ययनं कृतवन्तः यत् ग्लाइकोसाइलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल् (GPI) एंकरप्रोटीन्स् (GPI-APs) कथं ईआरतः भिन्नरूपेण निर्यातिताः भवन्ति। जीपीआई-एपीस् लिपिड्-सम्बद्धानां कोशिकापृष्ठप्रोटीनानां विविधाः सन्ति ( ६, ७) । जीपीआई-एपी ग्लाइकोलिपिड् अंशस्य (जीपीआई एंकर) माध्यमेन प्लाज्मा झिल्लीयाः बाह्यपत्रेषु संलग्नः स्रावितः प्रोटीनः अस्ति । ते जीपीआई एंकरं ईआर लुमेन् (8) इत्यस्मिन् रूढिवादी अनुवादोत्तरसंशोधनरूपेण स्वीकुर्वन्ति। संलग्नतायाः अनन्तरं जीपीआई-एपी गोल्गी-यन्त्रेण (5, 9) ईआरतः प्लाज्मा-झिल्लीं प्रति गच्छति । जीपीआई लंगरस्य उपस्थित्या जीपीआई-एपी स्रावमार्गेण (5, 9, 10) सह झिल्लीपारस्रावितप्रोटीनात् (अन्यप्लाज्माझिल्लीप्रोटीनसहिताः) पृथक् परिवहनं भवति खमीरकोशिकासु GPI-APs अन्तःप्लाज्मिकजालस्य अन्येभ्यः स्रावितप्रोटीनेभ्यः पृथक् भवन्ति, ततः कोटप्रोटीनसङ्कुल II (COPII) (6, 7) द्वारा लपेटितेषु अद्वितीयपुटिकासु संकुलिताः भवन्ति ईआर निर्यातप्रक्रियायां अस्याः वर्गीकरणप्रक्रियायाः निर्धारकाः अस्पष्टाः सन्ति, परन्तु अनुमानं भवति यत् अस्य तन्त्रस्य कृते लिपिडस्य आवश्यकता भवितुम् अर्हति, विशेषतः जीपीआई लंगरस्य लिपिडभागस्य संरचनात्मकपुनर्निर्माणस्य (5, 8) खमीरे जीपीआई-लिपिड्-पुनर्निर्माणं जीपीआई-संलग्नतायाः तत्क्षणमेव आरभ्यते, अनेकेषु सन्दर्भेषु च, सेरामाइड्-इत्यस्य २६-कार्बन-दीर्घ-शृङ्खला-संतृप्त-वसा-अम्ले (C26:0) (11, 12) इत्यनेन सह बन्धनं भवति अद्यावधि खमीरकोशिकाभिः उत्पादितः मुख्यः सेरामाइड् C26 सेरामाइड् अस्ति । इदं ईआर-मध्ये संश्लेषितं भवति तथा च अधिकांशं COPII-पुटिकाद्वारा गोल्गी-यन्त्रे निर्यातं भवति (13) । जीपीआई-एपी इत्यस्य ईआर निर्यातार्थं विशेषतया निरन्तरसेरामाइडसंश्लेषणस्य (14, 15) आवश्यकता भवति, तथा च, गोल्गी-यन्त्रे सेरामाइडस्य इनोसिटोल फॉस्फेट् सेरामाइड् (IPC) मध्ये परिवर्तनं जीपीआई लंगरसंश्लेषणस्य उपरि निर्भरं भवति (16) कृत्रिमझिल्लीभिः सह जैवभौतिकीय-अध्ययनेन ज्ञातं यत् अत्यन्तं दीर्घाः एसिल्-शृङ्खला-सेरामाइड्स् एकीकृत्य अद्वितीय-भौतिक-गुणैः सह क्रमबद्ध-क्षेत्राणि निर्मातुं शक्नुवन्ति (17, 18) एते आँकडा: एतां परिकल्पनां जनयन्ति यत् C26 सेरामाइड् तथा C26 सेरामाइड् सह GPI-AP इत्येतयोः भौतिकगुणानां उपयोगं तुल्यकालिकरूपेण अव्यवस्थिते ER झिल्लीलिपिडवातावरणे क्रमबद्धक्षेत्रेषु अथवा क्षेत्रेषु एकीकृत्य भवति मुख्यतया लघु-असंतृप्त-ग्लिसेरोलिपिड्स् (C16:1 तथा C18:1) (19, 20) इत्यनेन निर्मितम् अस्ति । एते क्षेत्राः चयनात्मकरूपेण विशिष्टेषु ईआर-निर्गमस्थलेषु (ERES) केन्द्रीकृताः भविष्यन्ति, यत्र सेरामाइड्-सेरामाइड-आधारित-जीपीआई-एपी च एकस्मिन् एव समर्पिते COPII-पुटके (5) गोल्गी-नगरं प्रति सह-परिवहनं कर्तुं शक्यते
अस्मिन् अध्ययने अस्माभिः सुपर-रिजोल्यूशन कन्फोकल रियल-टाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (SCLIM) इत्यस्य उपयोगेन प्रत्यक्षतया एतस्य लिपिड-आधारित-तन्त्रस्य परीक्षणं कृतम्, यत् एकः अत्याधुनिक-माइक्रोस्कोपी-प्रविधिः अस्ति या एकत्रितरूपेण प्रतिदीप्ति-लेबल-युक्तानां प्रोटीनानां अवलोकनं कर्तुं शक्नोति त्रि-रङ्ग-त्रि-आयामी (3D) चित्रेषु जीवित-कोशिकासु अत्यन्तं उच्च-संकल्पः गतिः च भवति (21, 22)
वयं प्रथमं SCLIM प्रौद्योगिकीम् प्रयुक्तवन्तः यत् S. cerevisiae इत्यस्मिन् ER त्यक्त्वा C26 ceramide समूहेन सह सामान्य GPI-AP इत्यस्य परीक्षणं कथं कृतम् इति। ईआरस्य वर्गीकरणस्य जाँचार्थं वयं आनुवंशिकप्रणालीं प्रयुक्तवन्तः या प्रत्यक्षतया नवसंश्लेषितमालस्य ERES मध्ये प्रवेशं विवो (7, 23) दृश्यमानं कर्तुं शक्नोति। मालवाहकरूपेण, अस्माभिः हरितप्रतिदीप्तप्रोटीन (GFP) इत्यनेन लेबलं C26 सेरामाइड-आधारितं GPI-AP Gas1 तथा निकट-अवरक्त-प्रतिदीप्तिप्रोटीन (iRFP) इत्यनेन लेबलं कृत्वा ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2 च चयनं कृतम्, ये द्वे अपि प्लाज्मा-झिल्लीं लक्ष्यं कुर्वन्ति (24-26) sec31-1 तापमान-संवेदनशील-उत्परिवर्तने एतौ मालौ गैलेक्टोज-प्रेरक-प्रोमोटरस्य, संरचनात्मकस्य ERES-चिह्नस्य च अन्तर्गतं अभिव्यक्तौ भवतः । अत्यन्तं तापमाने (37°C), यतोहि sec31-1 उत्परिवर्तनं COPII अंकुरणं ER निर्यातं च निवारयितुं COPII कोटघटकस्य Sec31 इत्यस्य कार्यं प्रभावितं करोति, नवसंश्लेषितः मालः ER (23) इत्यत्र सञ्चितः भवति न्यूनतापमानं (२४°C) यावत् शीतलीकरणानन्तरं sec31-1 उत्परिवर्तितकोशिकाः स्रावक्षेत्रात् पुनः प्राप्ताः, सञ्चितस्य नूतनस्य कृत्रिममालस्य च ईआरतः निर्यातः आरब्धः CLIM दृश्यीकरणेन ज्ञातं यत् नवसंश्लेषितस्य अधिकांशः Gas1-GFP तथा Mid2-iRFP अद्यापि 37°C मध्ये ऊष्मायनानन्तरं sec31-1 उत्परिवर्तितकोशिकानां ER मध्ये संचितः अस्ति ततः 24°C मध्ये 5 निमेषपर्यन्तं मुक्तः भवति (चित्रम् 1)। यतो हि Mid2-iRFP सम्पूर्णे ER झिल्लीयां वितरितं भवति, तथा च Gas1-GFP असंतत ER झिल्लीक्षेत्रे सान्द्रीकृत्य एकत्रितं भवति, तेषां वितरणं सर्वथा भिन्नं भवति (चित्रम् 1, A तः C पर्यन्तं तथा च Movie S1) तदतिरिक्तं यथा चित्रे 1D दर्शितं तथा Gas1-GFP समूहे Mid2-iRFP नास्ति । एते परिणामाः सूचयन्ति यत् जीपीआई-एपी तथा ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन् प्रारम्भे एव विभिन्नेषु ईआर झिल्लीप्रदेशेषु पृथक्कृताः आसन् । Gas1-GFP समूहः mCherry इत्यस्य COPII कोटप्रोटीन Sec13 (चित्रम् 1, E तथा F, तथा च चलचित्र S1) (23) इत्यनेन लेबलयुक्तस्य विशिष्टस्य ERES इत्यस्य समीपस्थः अस्ति ।
sec31-1 कोशिका गैलेक्टोज-प्रेरितं स्रावं अभिव्यक्तयन्ति, एकः दीर्घः एसिल् श्रृङ्खला (C26) सेरामाइड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, हरितः) तथा च ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन Mid2-iRFP (TMP, नीलः) तथा च एतत् Constructive ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37°C इत्यत्र 30 मिनट् यावत् इन्क्यूबेशनं कृतम्, स्थानान्तरितम् २४°C, तथा च SCLIM द्वारा ५ निमेषेभ्यः अनन्तरं प्रतिबिम्बितम् । (A to C) विमानस्य (A) प्रतिनिधिविलयितं वा एकल 2D चित्रं, 10 z-खण्डानां (B) 2D प्रक्षेपणप्रतिबिम्बं वा मालवाहनस्य ERES मार्करस्य (C) च 3D कोशिका गोलार्धप्रतिबिम्बं दर्शयति स्केल बार 1μm (A and B)। स्केल-एककं ०.५५१μm (C) अस्ति । Gas1-GFP इत्यस्य ज्ञापनं असतत-ER क्षेत्रेषु अथवा समूहेषु कृतम्, यदा तु Mid2-iRFP इत्यस्य ज्ञापनं कृत्वा सम्पूर्णे ER झिल्ली (C) मध्ये वितरितम् । (D) आलेखः श्वेतबाणरेखायाः (वामभागे) Gas1-GFP समूहे Gas1-GFP तथा Mid2-iRFP इत्येतयोः सापेक्षिकप्रतिदीप्तितीव्रता दर्शयति। AU, मनमाना एकक। (E तथा F) 3D चित्रं प्रतिनिधियन्ति यत् मालस्य ERES चिह्नस्य च संयोजनं करोति । विशिष्टस्य ERES इत्यस्य समीपे Gas1-GFP समूहाः ज्ञाताः आसन् । स्केल-एककं ०.५५१μm अस्ति । (F) श्वेत ठोस बाणः ERES इत्यनेन सह सम्बद्धं Gas1-GFP समूहं चिह्नयति । मध्यदक्षिणपटलेषु विलीनं विस्तारितं 3D चित्रं चयनितस्य Gas1-GFP समूहस्य च परिभ्रमितं दृश्यं च दृश्यते ।
Gas1-GFP समूहस्य विशिष्टस्य ERES च मध्ये निकटस्थानिकसम्बन्धः सूचयति यत् Gas1-GFP चयनात्मक ERES मध्ये प्रवेशं कर्तुं शक्नोति, यत् ER त्यक्तुं Mid2-iRFP द्वारा उपयुज्यमानस्य चयनात्मकतायाः भिन्नम् अस्ति एतस्याः सम्भावनायाः सम्बोधनाय वयं केवलं एकस्य वा द्वयोः वा मालयोः कृते ERES अनुपातस्य परिमाणं कृतवन्तः (चित्रम् २, A तः C पर्यन्तम्) । अस्माभिः ज्ञातं यत् अधिकांशः ERES (७०%) केवलं एकः प्रकारः मालः भवति । चित्र 2C इत्यस्य अधः चित्रे केवलं Gas1-GFP (चित्र 1) अथवा केवलं Mid2-iRFP (चित्र 2) इत्यनेन सह ERES इत्यस्य द्वौ विशिष्टौ उदाहरणौ दृश्यते । तस्य विपरीतम्, ERES इत्यस्य प्रायः २०% भागे द्वौ मालौ स्तः ये एकस्मिन् क्षेत्रे आच्छादिताः भवन्ति । केषुचित् ERES (१०%) द्विविधं मालवाहकं भवति इति ज्ञातम्, परन्तु ते स्पष्टतया भिन्नक्षेत्रेषु पृथक्कृताः आसन् । अतः एतत् सांख्यिकीयविश्लेषणं दर्शयति यत् ईआर निर्यातस्य अनन्तरं GPI-AP Gas1-GFP तथा च ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो Mid2-iRFP भिन्न-भिन्न ERES (चित्र 2D) इति विभक्ताः भवन्ति इयं क्रमणदक्षता पूर्वजैव रासायनिकविश्लेषणेन (6) रूपात्मकनिर्धारणेन (7) च अतीव सङ्गता अस्ति । ERES इत्यत्र प्रविष्टस्य क्वारेन्टाइन-मालस्य व्यवहारं अपि वयं अवलोकयितुं शक्नुमः (चित्रम् 2E तथा Movie S2)। चित्र 2E दर्शयति यत् Gas1-GFP (पैनल 3) अथवा Mid2-iRFP (पैनल 4) इत्यस्य केवलं लघुभागः एकतः ERES मध्ये प्रविशति तथा च असततक्षेत्रे सीमितः भवति चित्र 2E इत्यस्य पटल 5 दर्शयति यत् Gas1-GFP तथा Mid2-iRFP कदाचित् एकस्मिन् एव ERES मध्ये दृश्यन्ते, परन्तु ते भिन्नपक्षतः प्रविशन्ति तथा च पृथक् पृथक् क्षेत्रेषु केन्द्रीकृताः भवन्ति ये भिन्न-भिन्न COPII पुटिकासु प्रतिनिधित्वं कर्तुं शक्नुवन्ति अस्माभिः एतदपि पुष्टिः कृता यत् C26 सेरामाइड-आधारितस्य GPI-AP Gas1 इत्यस्य चयनात्मक ERES इत्यस्य रूपेण अवलोकितं पृथक्करणं वर्गीकरणं च विशिष्टं भवति यतोहि अन्यः ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावभारः, GFP-टैग्ड् प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन Axl2 (27 ), Mid2-iRFP इत्यस्य सदृशं व्यवहारं दर्शयति। (चित्र S1 तथा चलचित्र S3)। नवसंश्लेषितं Axl2-GFP Mid2-iRFP इव ER झिल्लीद्वारा वितरितं भवति (चित्रं S1, A तथा B), तथा च अधिकांश ERES (चित्र S1, B तः D) मध्ये Mid2-iRFP इत्यनेन सह सह-स्थानीयं भवति चित्र 1. S1C इत्यस्य पटल 1 तथा 2 ERES इत्यस्य द्वौ विशिष्टौ उदाहरणौ दर्शयति यत्र द्वौ ट्रांसमेम्ब्रेन मालौ ओवरलैप् भवति। एतेषु सन्दर्भेषु द्वयोः मालयोः एकत्र ERES इत्यत्र प्रवेशः भवति (चित्रम् S1E, Panel 3 तथा Movie S3) ।
गैलेक्टोज प्रेरकस्रावः, Gas1-GFP (GPI-AP, हरितः) तथा Mid2-iRFP (TMP, नीलः) तथा च संरचनात्मकः ERES लेबलिंग् Sec13-mCherry (ERES, magenta) अभिव्यक्तं कुर्वन्तः sec31-1 कोशिकाः °C इत्यत्र 30 मिनिट् यावत् इन्क्यूबेशनस्य अनन्तरं 37 °C इत्यत्र स्थापिताः, स्रावखण्डं मुक्तुं 24 °C यावत् स्थानान्तरं कुर्वन्तु, ततः परं SCLIM इत्यनेन सह प्रतिबिम्बं कुर्वन्तु २० मिनिट्। (A to C) मालवाहकस्य प्रतिनिधि 2D प्रक्षेपणप्रतिमानि (A; स्केलबार, 1μm) अथवा 3D कोशिकागोलार्धप्रतिमानि (B and C; scale unit, 0.456μm) तथा ERES द्वारा चिह्नितानि 10 z-खण्डानि। (B) इत्यस्मिन् निम्नपटलः (C) इत्यस्मिन् च पटलः केवलं ERES (magenta) [Gas1-GFP (ग्रे) तथा Mid2-iRFP (हल्के नीले)] इत्यस्मिन् उपस्थितानां मालानाम् प्रदर्शनार्थं संसाधितानि चित्राणि प्रदर्शयति (C) मुक्तबाणः : ERES केवलं एकं मालखण्डं (1 तः 4 पर्यन्तं) वहति। ग्रे बाणः : ERES इत्यत्र पृथक्कृतः मालः (5) अस्ति । श्वेत ठोस बाणः सह-स्थितं मालम् युक्तं ERES। अधः: चयनितैकल ERES मध्ये केवलं Gas1-GFP (1) अथवा Mid2-iRFP (2) भवति । स्केल बार, 100 एनएम। (D) (C) इत्यस्मिन् वर्णितस्य प्रकाशसूक्ष्मचित्रस्य परिमाणीकरणम् । ERES इत्यस्य औसतप्रतिशतं यस्मिन् केवलं एकः मालः (Gas1-GFP अथवा Mid2-iRFP), पृथक्कृतः मालः, अतिव्याप्तः मालः च भवति । स्वतन्त्रप्रयोगत्रयेषु ५४ कोशिकासु n=४३२ । त्रुटिपट्टिका = एसडी। द्विपुच्छा अयुग्मित टी परीक्षण। *** पी = 0.0002। (E) (C) इत्यनेन चिह्नितस्य क्वारेन्टाइनस्य मालस्य चयनितस्य ERES इत्यस्य 3D चित्रम्। Gas1-GFP (हरितः) (3) अथवा Mid2-iRFP (नीला) (4) एकतः ERES (magenta) इत्यत्र प्रविशति तथा च ERES इत्यस्य अन्तः लघुक्षेत्रे प्रतिबन्धितः भवति । कदाचित्, उभयप्रकारस्य मालवस्तु एकस्मात् पार्श्वेण एकस्मिन् एव ईआरईएस (5) प्रविशति, ईआरईएस-अन्तर्गतं पृथक् क्षेत्रे एव सीमितं भवति । स्केल बार, 100 एनएम।
तदनन्तरं वयं एकां परिकल्पनां परीक्षितवन्तः यत् ईआर-झिल्लीयां वर्तमानः दीर्घः एसिल्-शृङ्खला-सेरामाइड् (C26) Gas1 इत्यस्य विशिष्टं समूहीकरणं, चयनात्मकं ERES-मध्ये क्रमणं च चालयति अस्य कृते वयं परिवर्तितं खमीर-प्रभेदं GhLag1 इत्यस्य उपयोगं कृतवन्तः, यस्मिन् अन्तःजात-सेरामाइड-सिन्थेजद्वयं Lag1 तथा Lac1 इत्येतयोः स्थाने GhLag1 (कपासस्य Lag1 समरूपः) इत्यनेन प्रतिस्थापितः, यस्य परिणामेण वन्यप्रकारात् लघुः कोशिकाझिल्ली सेरामाइड-उपभेदः (चित्रम् 3A) (28) इति खमीर-उपभेदः अभवत् द्रव्यमानवर्णक्रममापनेन (MS) विश्लेषणेन ज्ञातं यत् वन्यप्रकारस्य उपभेदेषु कुलसेरामाइडस्य ९५% भागः अतीव दीर्घः (C26) श्रृङ्खला सेरामाइडः भवति, यदा तु GhLag1 इत्यस्मिन् ८५% सेरामाइडः अतीव दीर्घः (C18 तथा C16) भवति ), सेरामाइडस्य केवलं २% भागः अतीव दीर्घः (C26) श्रृङ्खला सेरामाइड् अस्ति । यद्यपि C18 तथा C16 सेरामाइड् अद्यावधि GhLag1 झिल्लीयां ज्ञाताः मुख्याः सेरामाइडाः सन्ति तथापि MS विश्लेषणेन एतदपि पुष्टिः कृता यत् GhLag1 तनावे अभिव्यक्तस्य Gas1-GFP इत्यस्य GPI लंगरस्य C26 सेरामाइड् अस्ति, यत् वन्यप्रकारस्य लिपिड् इत्यनेन सह तुलनीयम् अस्ति गुणः समानः (चित्रम् ३ क) (२६) । अतः अस्य अर्थः अस्ति यत् सेरामाइड् पुनर्निर्माण एन्जाइम Cwh43 C26 सेरामाइडस्य कृते अत्यन्तं चयनात्मकं भवति, यथा चित्रे 26 दर्शितं, एतत् GhLag1 तनावे C26 सेरामाइडस्य अल्पमात्रायां GPI लंगरं प्राधान्येन समावेशयति S2 (29) इति । तथापि GhLag1 इत्यस्य कोशिकाझिल्लीयां मूलतः केवलं C18-C16 सेरामाइड् भवति, यदा तु Gas1-GFP इत्यस्य अद्यापि C26 सेरामाइड् भवति । एतत् तथ्यं ईआर-मध्ये झिल्ली-सेरामाइड्-इत्यस्य एसिल्-शृङ्खला-दीर्घतायाः समस्यायाः विशेषरूपेण समाधानार्थं आदर्श-उपकरणं करोति । वर्गस्य, क्रमणस्य च काल्पनिकभूमिका। ततः, अस्माभिः प्रथमं पारम्परिकप्रतिदीप्तिसूक्ष्मदर्शिकायाः ​​माध्यमेन sec31-1 इत्यस्य तापमान-संवेदनशील-उत्परिवर्तित-एलील-सहितं GhLag1 इत्यस्मिन् समूहेषु संचयस्य क्षमतायाः अध्ययनं कृतम्, यत्र केवलं दीर्घा (C18-C16) श्रृङ्खला ईआर-झिल्ली-सेरामाइडे (चित्रम् 3) विद्यते अस्माभिः अवलोकितं यत् sec31-1 इत्यस्मिन् अधिकांशः Gas1-GFP समूहेषु केन्द्रितः आसीत्, यदा तु दीर्घ (C18-C16) दीर्घसेरामाइड ईआर झिल्ली सह sec31-1 GhLag1 इत्यस्मिन् Gas1-GFP मुख्यतया सम्पूर्णे ईआर झिल्लीयां समूहितः न वितरितः च आसीत् सटीकं वक्तुं, यतः C26 सेरामाइड-आधारित-क्लस्टरिंग् विशिष्ट-ERES (चित्रम् 1) इत्यनेन सह निकटतया सम्बद्धम् अस्ति, अतः अस्माभिः तदनन्तरं अन्वेषणं कृतम् यत् एषा प्रक्रिया ER निर्यात-प्रोटीन-तन्त्रस्य कार्यं अपि सम्मिलितं भवितुम् अर्हति वा इति GPI-AP ER निर्यातार्थं विशेष COPII प्रणालीं उपयुज्यते, यत् GPI एंकरस्य ग्लाइकन भागस्य Ted1′s संरचनात्मकपुनर्निर्माणेन सक्रियरूपेण नियमितं भवति (30, 31) ततः पुनर्संयोजितं GPI-ग्लाइकनं ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 परिसरेण ज्ञायते, यत् क्रमेण Lst1 इत्यस्य चयनात्मकरूपेण भर्तीं करोति, यत् प्रमुखस्य COPII मालबन्धन उप-एककस्य Sec24 इत्यस्य विशिष्टं समरूपं भवति, GPI-AP-समृद्धं COPII पुटिकां निर्माय आवश्यकं भवति (31-33) अतः, अस्माभिः एकं द्विगुणं उत्परिवर्तितं निर्मितं यत् एतेषां एकलप्रोटीनानां (p24 जटिलघटकः Emp24, GPI-ग्लाइकन पुनर्निर्माण एन्जाइम Ted1 तथा विशिष्टः COPII उप-एककः Lst1) sec31-1 उत्परिवर्तित-उपभेदेन सह विलोपनं संयोजितवान्, तथा च तेषां अध्ययनं कृतवान् Is it possible to form Gas1-cluster GFP (चित्र 3)। अस्माभिः अवलोकितं यत् sec31-1emp24Δ तथा sec31-1ted1Δ इत्यत्र Gas1-GFP मुख्यतया असमूहीकृतः अस्ति तथा च सम्पूर्णे ER झिल्लीयां वितरितः अस्ति, यथा पूर्वं sec31-1 GhLag1 इत्यत्र दृष्टम्, यदा sec31-1lst1Δ इत्यत्र Gas1-GFP Like sec31-1 इत्यत्र। एते परिणामाः सूचयन्ति यत् ER झिल्लीयां C26 सेरामाइडस्य उपस्थितेः अतिरिक्तं Gas1-GFP इत्यस्य समूहीकरणस्य अपि p24 परिसरेण सह बन्धनस्य आवश्यकता वर्तते, तथा च विशिष्टस्य Lst1 भरणस्य आवश्यकता नास्ति ततः, वयं संभावनां अन्वेषितवन्तः यत् ER झिल्लीयां सेरामाइडस्य श्रृङ्खलादीर्घता Gas1-GFP इत्यस्य p24 प्रति बन्धनं नियमितं कर्तुं शक्नोति। परन्तु अस्माभिः ज्ञातं यत् झिल्लीयां C18-C16 सेरामाइडस्य उपस्थितिः p24 परिसरेण पुनर्निर्माणं कृतं GPI-ग्लाइकैन्स् (चित्रं S3 तथा S4, A तथा B) अथवा GPI-AP इत्यनेन सह बन्धनं GPI-AP निर्यातं च न प्रभावितं करोति। क्षमता। COPII उपप्रकार Lst1 (चित्र S4C) भर्ती करें। अतः C26 सेरामाइड-निर्भर-समूहीकरणस्य कृते भिन्न-भिन्न-ER निर्यात-प्रोटीन-तन्त्रैः सह प्रोटीन-अन्तर्क्रियायाः आवश्यकता नास्ति, परन्तु लिपिड-दीर्घतायाः चालितस्य वैकल्पिकस्य क्रमण-तन्त्रस्य समर्थनं करोति ततः, अस्माभिः विश्लेषितं यत् ईआर झिल्लीयां सेरामाइड एसिल् श्रृङ्खलादीर्घता चयनात्मक ERES रूपेण Gas1-GFP इत्यस्य प्रभावी वर्गीकरणार्थं महत्त्वपूर्णा अस्ति वा। यतो हि लघुशृङ्खला-सेरामाइड्-युक्ते GhLag1-उपभेदे Gas1 ER-तः निर्गत्य प्लाज्मा-झिल्लीं प्रविशति (चित्रम् S5), अस्माकं मतं यत् यदि सेरामाइड-एसिल्-शृङ्खलायाः दीर्घतायाः आधारेण क्रमणं चालितं भवति तर्हि GhLag1-उपभेदस्य Gas1 पुनः निर्दिश्य पारं कर्तुं शक्यते समानझिल्लीयुक्तानि ERES मालाः।
(A) GhLag1 इत्यस्य कोशिकाझिल्लीयां मुख्यतया लघुतराः C18-C16 सेरामाइडाः सन्ति, यदा तु Gas1-GFP इत्यस्य GPI लंगरस्य अद्यापि वन्यप्रकारस्य कोशिकानां समानः C26 IPC अस्ति उपरि: द्रव्यमानवर्णक्रममापनेन (MS) वन्यप्रकारस्य (Wt) तथा GhLag1p उपभेदानाम् कोशिकाझिल्लीयां सेरामाइडस्य एसिल् श्रृङ्खलादीर्घताविश्लेषणम्। दत्तांशः कुलसेरामाइडस्य प्रतिशतं प्रतिनिधियति । त्रयाणां स्वतन्त्रप्रयोगानाम् औसतम् । त्रुटिपट्टिका = एसडी। द्विपुच्छा अयुग्मित टी परीक्षण। **** पी <0.0001. तलफलकम् : वन्यप्रकारस्य तथा GhLag1p उपभेदयोः अभिव्यक्तस्य Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI लंगरस्य वर्तमानस्य IPC इत्यस्य एसिल् श्रृङ्खलादीर्घतायाः MS विश्लेषणम्। दत्तांशः कुल IPC संकेतस्य प्रतिशतं प्रतिनिधियति । पञ्च स्वतन्त्रप्रयोगानाम् औसतम्। त्रुटिपट्टिका = एसडी। द्विपुच्छा अयुग्मित टी परीक्षण। नस्, न महत्त्वपूर्णम् । पी = 0.9134। (B) sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ तथा sec31-1lst1Δ कोशिकानां प्रतिदीप्तिसूक्ष्मचित्रं गैलेक्टोज-प्रेरितं Gas1-GFP अभिव्यक्तं कृत्वा 37°C पर 30 मिनिट् यावत् इन्क्यूबेशनं कृत्वा तदनन्तरं नियमितप्रतिदीप्तिसूक्ष्मदर्शनं कर्तुं अधः प्रेषितम् २४° से. श्वेत बाणः ER Gas1-GFP समूहः। खुला बाणः : असमूहीकृतः Gas1-GFP सम्पूर्णे ईआर-झिल्लीयां वितरितः भवति, यत् ईआर-लक्षणं नाभिकीय-वलय-रञ्जनं दर्शयति । स्केल बार, 5μm। (C) (B) इत्यत्र वर्णितस्य प्रकाशसूक्ष्मचित्रस्य परिमाणीकरणम्। विरामयुक्त Gas1-GFP संरचनायुक्तानां कोशिकानां औसतप्रतिशतम्। त्रयोः स्वतन्त्रप्रयोगेषु n≥300 कोशिका। त्रुटिपट्टिका = एसडी। द्विपुच्छा अयुग्मित टी परीक्षण। **** पी <0.0001.
प्रत्यक्षतया एतस्याः समस्यायाः समाधानार्थं वयं sec31-1 तापमान-संवेदनशील-उत्परिवर्तित-एलीलेन सह GhLag1 इत्यस्मिन् Gas1-GFP तथा Mid2-iRFP इत्यस्य SCLIM दृश्यीकरणं कृतवन्तः (चित्रम् 4 तथा Movie S4)। ईआर ३७ डिग्री सेल्सियस इत्यत्र अवधारणं कृत्वा तदनन्तरं २४ डिग्री सेल्सियस इत्यत्र मुक्तं कृत्वा नवसंश्लेषितस्य अधिकांशः Gas1-GFP इत्यस्य समूहः न अभवत् तथा च सम्पूर्णे ईआर झिल्लीयां वितरितः नासीत्, यथा पारम्परिकसूक्ष्मदर्शकैः अवलोकितम् (चित्रम् ४, ए तथा बी) तदतिरिक्तं ERES इत्यस्य बृहत् प्रतिशतं (६७%) तस्मिन् सह-स्थितौ द्वौ प्रकारौ मालवस्तौ अन्तर्भवति (चित्रम् ४D) । चित्र 4C इत्यस्य फलक 1 तथा 2 मध्ये Gas1-GFP तथा Mid2-GFP इत्येतयोः उपरि आच्छादितस्य ERES इत्यस्य द्वौ विशिष्टौ उदाहरणौ दर्शितौ स्तः । तदतिरिक्तं द्वयोः मालयोः एकस्मिन् एव ERES (चित्रं 4E, panel 3 and movie S4) नियुक्तम् । अतः अस्माकं परिणामाः सूचयन्ति यत् ईआर-झिल्लीयां सेरामाइड-एसिल्-शृङ्खलायाः दीर्घता ईआर-प्रोटीन-सङ्ग्रहस्य वर्गीकरणस्य च महत्त्वपूर्णः निर्धारकः अस्ति
गैलेक्टोज-प्रेरितं स्रावं, Gas1-GFP (GPI-AP, हरितं) तथा Mid2-iRFP (TMP, नीले) तथा च संरचनात्मकं ERES-लेबलं Sec13-mCherry (ERES, magenta) व्यक्तं कुर्वन्तः Sec31-1 GhLag1 कोशिका 37°C पर इन्क्यूबेट् कुर्वन्ति। ३० निमेषान् यावत् निरन्तरं कुर्वन्तु, स्रावं मुक्तुं २४°C यावत् पतन्तु, २० निमेषेभ्यः अनन्तरं SCLIM इत्यनेन प्रतिबिम्बं कुर्वन्तु । (A to C) कार्गो तथा ERES द्वारा चिह्नित 10 z-खण्डों के प्रतिनिधि 2D प्रक्षेपण चित्र (A; स्केल बार, 1μm) अथवा 3D कोशिका गोलार्ध चित्र (B तथा C; स्केल यूनिट, 0.45μm)। (B) इत्यस्मिन् निम्नपटलः (C) इत्यस्मिन् च पटलः केवलं ERES (magenta) [Gas1-GFP (ग्रे) तथा Mid2-iRFP (हल्के नीले)] इत्यस्मिन् उपस्थितानां मालानाम् प्रदर्शनार्थं संसाधितानि चित्राणि प्रदर्शयति (C) श्वेत पूरितः बाणः : ERES, मालस्य अतिव्याप्तिः। Open arrow: ERES इत्यत्र केवलमेकं वस्तु अस्ति । निम्नपटलः : चयनित ERES मध्ये (C) मध्ये चिह्नितं ओवरलैपिंग मालम् (1 तथा 2) भवति । स्केल बार, 100 एनएम। (D) (C) इत्यस्मिन् वर्णितस्य प्रकाशसूक्ष्मचित्रस्य परिमाणीकरणम् । sec31-1 तथा sec31-1 GhLag1 इकाईषु केवलं एकः मालः (Gas1-GFP अथवा Mid2-iRFP) समाविष्टः अस्ति, तथा च पृथक्कृतमालस्य तथा ओवरलैपिंग मालस्य कृते ERES इत्यस्य औसतप्रतिशतम् त्रयोः स्वतन्त्रप्रयोगेषु ५४ कोशिकासु (sec31-1) n = 432, 47 कोशिकासु (sec31-1 GhLag1) n = 430 च । त्रुटिपट्टिका = एसडी। द्विपुच्छा अयुग्मित टी परीक्षण। *** पी = 0.0002 (sec31-1) तथा ** पी = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (E) (C) इत्यत्र चिह्नितस्य ओवरलैपिंग कार्गो (3) सह चयनितस्य ERES इत्यस्य 3D चित्रम्। Gas1-GFP (हरा) तथा Mid2-iRFP (नीला) एकस्मात् पार्श्वे ERES (magenta) इत्यस्य समीपं गत्वा एकस्मिन् एव ERES प्रतिबन्धितक्षेत्रे तिष्ठन्ति । स्केल बार, 100 एनएम।
अयं अध्ययनं प्रत्यक्षं इन विवो प्रमाणं प्रदाति यत् लिपिड-आधारित-प्रोटीन-मालस्य वर्गीकरणं स्रावमार्गे चयनात्मक-निर्यात-स्थलेषु भवति, तथा च वर्गीकरण-चयनात्मकतायाः कृते एसिल्-शृङ्खला-दीर्घतायाः महत्त्वं प्रकाशयति SCLIM इति नामकस्य शक्तिशालिनः अत्याधुनिकसूक्ष्मदर्शनप्रविधिस्य उपयोगेन वयं खमीरे नवसंश्लेषितं Gas1-GFP (अतिदीर्घ एसिल् श्रृङ्खला (C26) सेरामाइड लिपिडभागयुक्तः प्रमुखः प्लाज्मा झिल्ली GPI-AP) प्रदर्शितवन्तः ) असतत ERs मध्ये समूहीकृताः क्षेत्राः विशिष्ट ERES इत्यनेन सह सम्बद्धाः सन्ति, यदा तु ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावितप्रोटीनानि सम्पूर्णे ER झिल्लीद्वारा वितरितानि सन्ति (चित्रम् १)। तदतिरिक्तं एतौ प्रकारौ मालौ चयनात्मकरूपेण भिन्न-भिन्न-ईआरईएस-मध्ये प्रविशति (चित्रम् २) । झिल्लीयां कोशिकीयसेरामाइडस्य एसिल् श्रृङ्खलादीर्घता C26 तः C18-C16 यावत् न्यूनीभवति, Gas1-GFP समूहः असतत ER क्षेत्रे बाधितः भवति, तथा च Gas1-GFP पुनः मार्गं कृत्वा ER तः ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन सह समान ERES मार्गेण निर्गन्तुं भवति (चित्रम् 3 तथा चित्रम् 3) ४) ।
यद्यपि GPI-AP ER निर्गन्तुं विशेषप्रोटीनतन्त्रस्य उपयोगं करोति तथापि अस्माभिः ज्ञातं यत् C26 सेरामाइड-निर्भरं पृथक्करणं विभेदकप्रोटीनपरस्परक्रियासु न निर्भरं भवति यत् ERESविशेषीकरणं जनयितुं शक्नोति (चित्रं S4 तथा S5)। तस्य स्थाने अस्माकं निष्कर्षाः लिपिड्-आधारित-प्रोटीन-समूहीकरणेन चालितस्य वैकल्पिक-वर्गीकरण-तन्त्रस्य समर्थनं कुर्वन्ति, तदनन्तरं अन्येषां माल-वाहनानां बहिष्कारेन च। अस्माकं अवलोकनानि सूचयन्ति यत् एकेन विशिष्टेन ERES इत्यनेन सह सम्बद्धे Gas1-GFP क्षेत्रे अथवा समूहे ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावितप्रोटीन Mid2-iRFP इत्यस्य अभावः अस्ति, यत् सूचयति यत् C26 सेरामाइड-निर्भरः GPI-AP समूहः प्रासंगिक-ERES-मध्ये तेषां प्रवेशं सुलभं करिष्यति, तथा च, तत्सह, ट्रांसमेम्ब्रेन् बहिष्कृत्य स्रावः अस्मिन् विशेषे ERES-मध्ये प्रवेशं करोति (चित्रम् 1 तथा 2)। तस्य विपरीतम्, ER झिल्लीयां C18-C16 सेरामाइड् इत्यस्य उपस्थित्या GPI-AP इत्यस्य क्षेत्राणि वा समूहाः वा न निर्मान्ति, अतः ते झिल्लीपारस्रावितप्रोटीनानि समाने ERES मध्ये बहिष्कृत्य वा प्रतिस्थापयितुं वा न कुर्वन्ति (चित्रम् 3 तथा 4) . अतः वयं प्रस्तावयामः यत् C26 सेरामाइड् विशिष्ट ERES इत्यनेन सह सम्बद्धानां प्रोटीनानां समूहीकरणं सुलभं कृत्वा पृथक्करणं वर्गीकरणं च चालयति।
विशिष्टे ER क्षेत्रे एतत् C26 सेरामाइड-निर्भरं समूहीकरणं कथं प्राप्तुं शक्यते? झिल्ली सेरामाइडस्य पार्श्विकरूपेण पृथक् भवितुं प्रवृत्तिः GPI-AP तथा C26 सेरामाइड् इत्येतयोः लघुतरं असंतृप्तं च ग्लिसरॉलिपिड्स् युक्तस्य ER झिल्लीयाः अधिक अनियमितलिपिडवातावरणे लघु-तत्क्षणिकरूपेण क्रमबद्धं लिपिड् निर्मातुं शक्नोति गुणवत्ता समूह (17, 18)। एते लघु अस्थायी समूहाः p24 परिसरेण सह बन्धनस्य अनन्तरं बृहत्तरेषु, अधिकस्थिरसमूहेषु अधिकं संलयनं कर्तुं शक्यन्ते (34) । अस्य अनुरूपं वयं दर्शितवन्तः यत् C26 Gas1-GFP इत्यस्य बृहत्तरदृश्यसमूहानां निर्माणार्थं p24 परिसरेण सह अन्तरक्रियायाः आवश्यकता वर्तते (चित्रम् ३) । p24 परिसरः खमीरे (35) चतुर्भिः भिन्नैः p24 ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीनैः निर्मितः विषमयुग्मजः ओलिगोमरः अस्ति, यः बहुसंयोजकबन्धनं प्रदाति, यत् लघु GPI-AP समूहानां क्रॉस्-लिङ्किङ्गं जनयितुं शक्नोति, तस्मात् बृहत्तरं Stable समूहं (34) जनयति GPI-APs इत्यस्य प्रोटीन ectodomains मध्ये अन्तरक्रिया अपि तेषां एकत्रीकरणे योगदानं दातुं शक्नोति, यथा स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिकासु तेषां Golgi परिवहनस्य समये दर्शितम् ( 36 ). परन्तु यदा C18-C16 सेरामाइड् ER झिल्लीयां भवति तदा p24 परिसरः Gas1-GFP इत्यनेन सह बन्धनं करोति तदा बृहत् पृथक् समूहाः न निर्मीयन्ते अन्तर्निहितं तन्त्रं दीर्घस्य एसिल्-शृङ्खला-सेरामाइडस्य विशिष्ट-भौतिक-रासायनिक-गुणानां उपरि निर्भरं भवितुम् अर्हति । कृत्रिमझिल्लीनां जैवभौतिक-अध्ययनेन ज्ञायते यत् यद्यपि दीर्घाः (C24) लघु (C18-C16) च एसिल्-शृङ्खला-सेरामाइड्-द्वयं चरणपृथक्करणं जनयितुं शक्नोति तथापि केवलं दीर्घ-एसिल्-शृङ्खला-सेरामाइड् (C24) एव उच्च-वक्रतां प्रवर्धयितुं शक्नोति तथा च फ़िल्म-मोचनं च चलचित्रस्य पुनः आकारं दातुं शक्नोति परस्परसन्दर्भद्वारा (१७, ३७, ३८)। दर्शितं यत् Emp24 इत्यस्य मानवसमरूपस्य TMED2 इत्यस्य ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्सः कोशिकाद्रव्यस्य लोब्युलेषु C18 सेरामाइड-आधारित-स्फिंगोमाइलिनेन सह चयनात्मकरूपेण अन्तरक्रियां करोति (39) आणविकगतिविज्ञानस्य (MD) अनुकरणस्य उपयोगेन अस्माभिः ज्ञातं यत् C18 तथा C26 सेरामाइड् इत्येतयोः द्वयोः अपि Emp24 ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्सस्य कोशिकाद्रव्यस्य लोब्युल्स् इत्यस्य परितः सञ्चयः भवति, तेषां समानानि प्राधान्यानि सन्ति (चित्रम् S6) ज्ञातव्यं यत् एतेन ज्ञायते यत् Emp24 इत्यस्य ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स् इत्यनेन झिल्लीयां लिपिड् इत्यस्य असममितवितरणं भवितुम् अर्हति । एतत् स्तनधारीकोशिकानां आधारेण अद्यतनं परिणामम् अस्ति । तथैव एमडी अनुकरणं ईथरलिपिड्स् (40) इत्यस्य उपस्थितिम् अपि दर्शयति । अतः वयं अनुमानं कुर्मः यत् ER26 इत्यस्य द्वयोः लोब्युलयोः C26 सेरामाइड् स्थानीयरूपेण समृद्धः अस्ति । यदा लुमिनल-लोबुलेषु GPI-AP प्रत्यक्षतया बहुसंयोजक p24 इत्यनेन सह सम्बद्धः भवति तथा च कोशिकाद्रव्य-लोब्युलेषु p24 इत्यस्य परितः C26 सेरामाइडस्य सञ्चयः भवति तदा तत् सहितं प्रोटीन-सङ्ग्रहणं प्रवर्धयितुं शक्नोति तथा च झिल्ली-वक्रता अङ्गुलीभिः (41) माध्यमेन उत्पद्यते, येन GPI-AP ERES-समीपस्थेषु असतत-प्रदेशेषु पृथक् भवति, यत् अपि अत्यन्तं वक्रस्य अनुकूलं भवति ईआर झिल्ली (42) के क्षेत्रों। पूर्वप्रतिवेदनेषु प्रस्तावितस्य तन्त्रस्य समर्थनं कृतम् (४३, ४४) । प्लाज्मा झिल्लीयां सेरामाइड-आधारित-ग्लाइकोस्फिन्गोलिपिड्स् (GSL) प्रति ओलिगोलेक्टिन्, रोगजनकानाम् अथवा प्रतिपिण्डानां बहुसंयोजकबन्धनं बृहत् GSL-सङ्ग्रहं प्रेरयति, चरणपृथक्करणं वर्धयति तथा च झिल्लीविरूपणं आन्तरिकीकरणं च जनयति (44) इवाबुची इत्यादि (43) ज्ञातं यत् दीर्घ (C24) परन्तु लघु न (C16) एसिल् श्रृङ्खलानां उपस्थितौ जीएसएल लैक्टोसाइलसेरामाइड् इत्यनेन सह बद्धः बहुसंयोजकलिगाण्डः बृहत् समूहानां निर्माणं झिल्लीप्रवेशं च प्रेरितवान्, तथा च पत्रकेषु कोशिकाद्रव्यं Lyn-मध्यस्थं संकेतसंप्रेषणं युग्मरूपेण एसिलशृङ्खलाभिः अन्तर्विभाजितं भवति न्यूट्रोफिल्स् ।
स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकलाकोशिकासु, एपिकल प्लाज्मा झिल्लीयाः स्तरपर्यन्तं एण्टी-गोल्गीजालस्य (TGN) सान्द्रता GPI-AP (10, 45) इत्यस्य पृथक्करणं क्रमणं च नियन्त्रयति इदं समुच्चयः GPI-AP ओलिगोमेराइजेशनेन (36) चालितः भवति, परन्तु एतत् खमीरे वयं यत् सेरामाइड् श्रृङ्खलादीर्घतां प्राप्नुमः तस्य उपरि अपि निर्भरं भवितुम् अर्हति । यद्यपि स्तनधारी GPI-AP एकः ईथर-लिपिड-आधारितः लंगरः अस्ति, तथा च तस्य रासायनिकसंरचना अत्यन्तं दीर्घा एसिल्-शृङ्खला-सेरामाइड् इत्यस्मात् बहु भिन्ना अस्ति, तथापि अद्यतन-अध्ययनेन ज्ञातं यत् द्वयोः लिपिडयोः विकासात्मकरूपेण समानाः भौतिकाः रासायनिकाः च गुणाः सन्ति And function (40) अतः स्तनधारीकोशिकासु ईथरलिपिडभागः खमीरे C26 सेरामाइडस्य सदृशः भवितुम् अर्हति, तस्य भूमिका च जीपीआई-एपी-सङ्ग्रहणं क्रमणं च प्रवर्धयितुं झिल्लीयां दीर्घशृङ्खलायुक्तेन सेरामाइडेन सह सम्बद्धता भवति यद्यपि एतस्याः सम्भावनायाः अद्यापि प्रत्यक्षपरीक्षणस्य आवश्यकता वर्तते तथापि पूर्वनिष्कर्षाः समर्थयन्ति यत् दीर्घ एसिल्-शृङ्खला-सेरामाइडस्य गोल्गी-शरीरस्य परिवहनं कोशिका-द्रव्य-स्थानांतरण-प्रोटीनैः न क्रियते, अपितु खमीर-सदृशानां जीपीआई-लंगरस्य संश्लेषणस्य उपरि निर्भरं भवति अतः विकासवादी रूढिवादी तन्त्रं अत्यन्तं दीर्घं एसिल् श्रृङ्खलायुक्तं सेरामाइडं जीपीआई-एपी (13, 16, 20, 46, 47) च एकस्मिन् परिवहनपुटके चयनात्मकरूपेण सहपरिवहनं कर्तुं समर्थं प्रतीयते।
खमीर-स्तनधारी-ध्रुवीकृत-उपकला-कोशिका-प्रणालीषु जीपीआई-एपी-सङ्ग्रहणं अन्येभ्यः प्लाज्मा-झिल्ली-प्रोटीनेभ्यः पृथक्करणं च सर्वं कोशिकापृष्ठं प्राप्तुं पूर्वं भवति पलाडिनो इत्यादि। (48) इत्यनेन ज्ञातं यत् स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकलाकोशिकानां TGN इत्यस्य उपरि GPI-AP समूहीकरणं न केवलं GPI-APs इत्यस्य चयनात्मकवर्गीकरणार्थं एपिकल प्लाज्मा झिल्लीं प्रति आवश्यकं भवति, अपितु GPI-APs इत्यस्य समूहीकरणसङ्गठनं तस्य जैविकक्रियाकलापं च नियन्त्रयति। कोष्ठपृष्ठम् । खमीरे अस्मिन् अध्ययने ज्ञातं यत् ईआर-उपरि C26 सेरामाइड-निर्भरः GPI-AP समूहः प्लाज्मा-झिल्लीयां GPI-AP इत्यस्य समूहसङ्गठनं कार्यात्मकक्रियाकलापं च नियन्त्रयितुं शक्नोति (24, 49)। अस्य मॉडलस्य अनुरूपं, GhLag1 कोशिका GPI अवरोधकानां वा औषधानां एलर्जी भवति ये कोशिका भित्ति अखण्डतां प्रभावितयन्ति (28), तथा च खमीरकोशिकानां संभोगे प्रक्षेपितस्य टिप् सेरामाइडस्य कार्यात्मकस्य Gas1-GFP समूहस्य (49) आवश्यकता G सूचयति hLag1 कोशिकानां सम्भाव्यशारीरिकपरिणामान्। GPI-AP त्रुटिः। परन्तु कोशिकापृष्ठस्य कार्यात्मकसङ्गठनं लिपिड्-दीर्घतायाः आधारेण क्रमण-पद्धत्या ईआर-तः प्रोग्रामितम् अस्ति वा इति अग्रे परीक्षणं अस्माकं भविष्यस्य शोधस्य विषयः भविष्यति
अस्मिन् कार्ये प्रयुक्ताः Saccharomyces cerevisiae उपभेदाः सारणी S1 मध्ये सूचीबद्धाः सन्ति । जीवितकोशिकाप्रतिबिम्बनार्थं SCLIM इत्यस्य MMY1583 तथा MMY1635 उपभेदाः W303 इत्यस्य पृष्ठभूमितः निर्मिताः आसन् । एकेन प्रतिदीप्तप्रोटीनटैगेन सह Sec13-mCherry अभिव्यक्तवन्तः एतेषां उपभेदानाम् निर्माणं बहुलकशृङ्खलाप्रतिक्रिया (PCR)-आधारितपद्धतेः उपयोगेन pFA6a प्लाज्मिड् इत्यनेन सह टेम्पलेटरूपेण (23) कृतम् GAL1 प्रवर्तकस्य नियन्त्रणे प्रतिदीप्तप्रोटीनेन लेबलं कृत्वा Mid2-iRFP अभिव्यक्तं तनावं निम्नलिखितरूपेण निर्मितम् । pKTiRFP-KAN वेक्टर (E. O'Shea, Addgene plasmid number 64687 इत्यस्य उपहार; http://n2t.net/addgene: 64687; शोध संसाधन पहचानकर्ता (RRID): Addgene_64687) इत्यस्मात् iRFP-KanMx अनुक्रमस्य PCR प्रवर्धनं तथा च अन्तःजातीय Mid2 इत्यस्य C-अन्तभागे सम्मिलितम्। Mid2-iRFP जीनोम अनुक्रमस्य प्रवर्धनं कृत्वा GAL1 प्रवर्तकस्य क्लोनीकरणस्य अनन्तरं एकीकरणप्लाज्मिड् pRS306 इत्यस्य Not I-Sac I साइट् इत्यत्र एकीकृतम् परिणामस्वरूपं प्लाज्मिड् pRGS7 Pst I इत्यनेन सह रेखीयीकरणं कृत्वा URA3 स्थाने एकीकृत्य स्थापितं ।
Gas1-GFP संलयनजीनः सेन्ट्रोमेर (CEN) प्लाज्मिड् इत्यस्मिन् GAL1 प्रवर्तकस्य नियन्त्रणे अभिव्यक्तः भवति, यस्य निर्माणं निम्नलिखितरूपेण भवति । Gas1-GFP अनुक्रमं pRS416-GAS1-GFP प्लाज्मिड् (24) (L. Popolo इत्यस्य उपहारः) इत्यस्मात् PCR द्वारा प्रवर्धितः आसीत् तथा च CEN प्लाज्मिड pBEVY-GL LEU2 (C इत्यस्य उपहारः) इत्यस्य Xma I–Xho I साइट् इत्यत्र क्लोनीकरणं कृतम् आसीत् मिलरः ; Addgene प्लाज्मिड संख्या 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; आरआरआईडी: Addgene_51225). परिणामस्वरूपं प्राप्तस्य प्लाज्मिड् इत्यस्य नाम pRGS6 इति अभवत् । Axl2-GFP संलयनजीनः अपि pBEVY-GL LEU2 वेक्टरस्य GAL1 प्रवर्तकस्य नियन्त्रणे अभिव्यक्तः भवति, तस्य निर्माणं च निम्नलिखितम् अस्ति । Axl2-GFP अनुक्रमं PCR द्वारा pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लाज्मिड् (23) तः प्रवर्धितम्, तथा च pBEVY-GL LEU2 वेक्टरस्य Bam HI-Pst I साइट् मध्ये क्लोनीकरणं कृतम्। परिणामस्वरूपं प्राप्तस्य प्लाज्मिड् इत्यस्य नाम pRGS12 इति अभवत् । अस्मिन् अध्ययने प्रयुक्तानां ओलिगोन्यूक्लिओटाइडानां अनुक्रमः सारणी S2 मध्ये सूचीबद्धः अस्ति ।
तनावस्य पूरकं ०.२% एडेनिन् तथा २% ग्लूकोज [YP-dextrose (YPD)], २% रफिनोज [YP-raffinose] समृद्ध खमीर अर्क प्रोटीन p (YP) माध्यम (१ % खमीर अर्क तथा २% प्रोटीन ept) इत्यनेन कृतम् (YPR)] अथवा 2% गैलेक्टोज [YP-गैलेक्टोज (YPG)] कार्बनस्रोतरूपेण, अथवा सिंथेटिक न्यूनतम माध्यमे (0.15% खमीर नाइट्रोजन आधारः 0.5% अमोनियम सल्फेट् च) पोषणार्थं आवश्यकानां समुचितानाम् अमीनो अम्लानाम् आधाराणां च पूरकत्वेन , तथा च 2% ग्लूकोज (सिंथेटिक ग्लूकोज न्यूनतम माध्यम) अथवा 2% गैलेक्टोज युक्तम् (सिंथेटिक गैलेक्टोज न्यूनतममाध्यमम्) कार्बनस्रोतरूपेण ।
वास्तविकसमयप्रतिबिम्बनस्य कृते GAL1 प्रवर्तकस्य अन्तर्गतं निर्माणं अभिव्यक्तं कुर्वन्तः तापमान-संवेदनशीलाः sec31-1 उत्परिवर्तितकोशिकाः YPR माध्यमे 24°C इत्यत्र रात्रौ मध्य-लॉग-चरणं यावत् वर्धिताः आसन् २४°C मध्ये १ घण्टापर्यन्तं YPG मध्ये प्रेरणस्य अनन्तरं कोशिकानां SG मध्ये ३७°C मध्ये ३० निमेषपर्यन्तं इन्क्यूबेशनं कृतम्, ततः स्रावखण्डात् मुक्तुं २४°C मध्ये स्थानान्तरितम् काचस्लाइड् इत्यत्र कोशिकानां स्थापनार्थं कोन्कानावलिन् ए इत्यस्य उपयोगः कृतः, SCLIM इत्यनेन च प्रतिबिम्बं कृतम् । SCLIM ओलम्पस IX-71 उल्टा प्रतिदीप्तिसूक्ष्मदर्शकस्य तथा UPlanSApo 100×1.4 संख्यात्मक एपर्चर तेल लेन्स (Olympus), उच्च-गति तथा उच्च-संकेत-शोर-अनुपात घूर्णन-डिस्क-कन्फोकल स्कैनर (Yokogawa Electric), कस्टम स्पेक्ट्रोमीटर्, तथा च कस्टम-शीतलनस्य संयोजनम् अस्ति The system's image intensifier (Hamamatsu फोटोनिक्स) ×266.7 इत्यस्य अन्तिमवर्धनेन सह आवर्धकलेन्सप्रणालीं प्रदातुं शक्नोति तथा च इलेक्ट्रॉनान् गुणयति इति चार्ज-युग्मितयन्त्रकॅमेरा (Hamamatsu Photonics) (21) प्रदातुं शक्नोति चित्राधिग्रहणं कस्टम् सॉफ्टवेयर (Yokogawa Electric) द्वारा क्रियते । 3D चित्राणां कृते वयं उद्देश्यचक्षुषः लम्बवत् स्पन्दनार्थं कस्टम-निर्मितस्य पीजोइलेक्ट्रिक-एक्ट्यूएटरस्य उपयोगं कृतवन्तः, तथा च प्रकाशीयभागाः 100 एनएम-अन्तरेण एकस्मिन् ढेरे एकत्रितवन्तः Z-stack इमेज 3D voxel data इत्यत्र परिवर्तितं भवति, तथा च घूर्णनचक्रस्य confocal microscope इत्यस्य कृते प्रयुक्तस्य सैद्धान्तिकबिन्दुप्रसारकार्यस्य उपयोगः Volocity software (PerkinElmer) द्वारा deconvolution processing कृते भवति सहस्थानविश्लेषणार्थं स्वयमेव सीमां स्थापयितुं Volocity सॉफ्टवेयरस्य उपयोगेन मालवस्तु सहितं ERES मापनं कृतम् । मेटामोर्फ सॉफ्टवेयर (Molecular Devices) इत्यस्य उपयोगेन रेखास्कैनविश्लेषणं कृतम् ।
सांख्यिकीयमहत्त्वं निर्धारयितुं GraphPad Prism सॉफ्टवेयरस्य उपयोगं कुर्वन्तु। द्विपुच्छस्य स्टूडेंटस्य टी-परीक्षायाः तथा साधारणस्य एकदिशा विचरणविश्लेषणस्य (ANOVA) परीक्षणस्य कृते समूहानां मध्ये अन्तरस्य P <0.05 (*) इत्यत्र महत्त्वपूर्णः प्रभावः इति मन्यते
Gas1-GFP इत्यस्य प्रतिदीप्तिसूक्ष्मदर्शनस्य कृते, लॉग चरणकोशिकाः YPD इत्यस्मिन् रात्रौ यावत् वर्धिताः, अपकेन्द्रीकरणेन च एकत्रिताः, फॉस्फेट बफरयुक्तेन लवणेन द्विवारं प्रक्षालिताः, न्यूनातिन्यूनं 15 निमेषपर्यन्तं हिमे इन्क्यूबेशनं कृतवन्तः, ततः पूर्वं वर्णितरीत्या सूक्ष्मदर्शिकायाः ​​अन्तर्गतं गतः चेक (24) अधिग्रहणार्थं वस्तुनिष्ठलेन्स, L5 (GFP) फ़िल्टर, Hamamatsu कैमरा, Application Suite X (LAS X) सॉफ्टवेयर च सुसज्जितस्य Leica DMi8 सूक्ष्मदर्शकस्य (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) उपयोगः कृतः .
नमूनानां 65°C मध्ये 10 निमेषपर्यन्तं SDS नमूनाबफरेन विकृतीकरणं कृतम्, ततः SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) द्वारा पृथक् कृतम्। इम्यूनोब्लॉटिङ्ग् विश्लेषणार्थं प्रतिलेन् १० μl नमूनाभारितम् आसीत् । प्राथमिकप्रतिपिण्डः : शशस्य बहुक्लोनलविरोधी-Gas1 1:3000 क्षीणतायां, शशस्य बहुक्लोनलविरोधी-Emp24 1:500 क्षीणतायां, शशस्य बहुक्लोनलविरोधी-GFP (H. Riezman इत्यस्य उपहारः) च 1:3000 क्षीणतायां च उपयोगं कुर्वन्तु। मूषकस्य मोनोक्लोनल एण्टी-Pgk1 प्रतिपिण्डस्य उपयोगः १:५००० (J. de la Cruz इत्यस्य उपहारः) इत्यस्य क्षीणीकरणे कृतः । द्वितीयकप्रतिपिण्डः : हॉर्सरैडिश पेरोक्साइडेज (HRP) संयुग्मितं बकरी-खरगोशविरोधी इम्यूनोग्लोबुलिन् जी (IgG) 1:3000 (Pierce) क्षीणीकरणे प्रयुक्तम् एच् आर पी-संयुग्मितं बकस्य मूषकविरोधी IgG इत्यस्य उपयोगः १:३००० (Pierce) इत्यस्य क्षीणीकरणे कृतः । प्रतिरक्षाप्रतिक्रियाक्षेत्रं सुपरसिग्नल वेस्ट् पिको अभिकर्मकस्य (Thermo Fisher Scientific) केमिलुमिनेसेन्स् पद्धत्या अवलोकितम् ।
यथा (31) इत्यत्र वर्णितं, समृद्धे ईआर-अंशे प्राकृतिकः प्रतिरक्षा-अवक्षेपण-प्रयोगः कृतः । संक्षेपेण, खमीरकोशिकानां TNE बफरेन [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride तथा protease inhibitor mixture) इत्यनेन 600 nm ( OD600) इत्यत्र 100 ऑप्टिकल घनत्वे द्विवारं प्रक्षाल्यताम्। काचमणिभिः भग्नं, ततः कोष्ठमलिनं काचमणिश्च अपकेन्द्रीकरणेन निष्कासितम् । ततः उपरितनं १७,००० ग्रामेषु ४ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं १५ निमेषपर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणं कृतम् । गोलीं TNE मध्ये पुनः निलम्बितं कृत्वा digitalis saponin 1% अन्तिमसान्द्रतां यावत् योजितम्। निलम्बनं ४ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं परिभ्रमणं कृत्वा १ घण्टापर्यन्तं इन्क्यूबेट् कृतम्, ततः ४ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं १३,००० ग्रामपर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणेन अघुलनशीलघटकाः ६० निमेषपर्यन्तं निष्कासिताः Gas1-GFP प्रतिरक्षावक्षेपस्य कृते प्रथमं नमूनां रिक्त-अगारोज-मणिभिः (ChromoTek) सह 4°C मध्ये 1 घण्टां यावत् पूर्व-इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु, ततः GFP-Trap_A (ChromoTek) इत्यनेन सह 4°C मध्ये 3 घण्टां यावत् इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु इम्यूनोप्रेसिपिटेट् मणिः ०.२% डाइगोक्सिजेनिन् युक्तेन TNE इत्यनेन पञ्चवारं प्रक्षाल्य SDS नमूनाबफरेन इल्युट् कृत्वा SDS-PAGE इत्यत्र पृथक् कृत्वा इम्यूनोब्लॉटिंग् इत्यनेन विश्लेषणं कृतम्
यथा (31) वर्णितं, समृद्धे ईआर-अंशे क्रॉस्-लिङ्किंग्-निर्धारणं कृतम् । संक्षेपेण, समृद्धं ईआर-अंशं 0.5 mM डाइथियोबिस्(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min) इत्यनेन सह इन्क्यूबेशनं कृतम् क्रॉसलिङ्किंग् प्रतिक्रिया ग्लाइसिन (50 mM अन्तिमसान्द्रता, 5 मिनट, 20°C) योजयित्वा शमितम्।
यथा पूर्वं वर्णितं (50), वन्यप्रकारस्य तथा GhLag1 उपभेदयोः सेरामाइडस्य MS विश्लेषणं कृतम् । संक्षेपेण, कोशिकानां 30°C मध्ये YPD इत्यस्मिन् घातीयचरणपर्यन्तं (3 तः 4 OD600 यूनिट्/ml) वर्धिताः, 25×107 कोशिकानां संग्रहणं कृतम् । तेषां चयापचयः त्रिक्लोरोएसिटिक अम्लेन शम्यते । निष्कर्षणविलायकस्य [इथेनॉल, जलं, ईथर, पाइरिडिन् तथा ४.२ एन अमोनियम हाइड्रोक्साइड् (१५:१५:५:१:०.०१८ v/v)] तथा आन्तरिकमानकस्य C17 सेरामाइड् (८६०५१७, अवन्टी ध्रुवीयलिपिड) गुणवत्तायाः १.२ एनएमओल् इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु अर्कस्य हल्कं क्षारीयजलविपाकं कर्तुं मोनोमिथाइलमाइन् अभिकर्मकस्य [मेथनॉल, जलं, एन-ब्यूटानोल् तथा मिथाइलमाइन् घोलस्य (4:3:1:5 v/v)] उपयोगं कुर्वन्तु, ततः जलसंतृप्तं एन-ब्यूटानॉलं लवणं विना उपयुज्यताम् अन्ते अर्कं सकारात्मकविधानविलायके [क्लोरोफॉर्म/मेथानॉल/जलं (२:७:१) + ५ एमएम अमोनियम एसीटेट्] पुनः निलम्ब्य द्रव्यमानवर्णक्रममापकस्य अन्तः प्रविष्टम् स्फिंगोलिपिड अणुनां पहिचानाय परिमाणनिर्धारणाय च बहुप्रतिक्रियानिरीक्षणं (MRM) कृतम् । TSQ Vantage तृतीयक चतुर्ध्रुवीय द्रव्यमानवर्णक्रममापकं (Thermo Fisher Scientific) लिपिड विश्लेषणार्थं रोबोटिक नैनोफ्लो आयनस्रोतेन Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) इत्यनेन सुसज्जितम् अस्ति प्रत्येकस्य सेरामाइडवर्गस्य कृते टकरावशक्तिः अनुकूलितः भवति । एमएस-दत्तांशः सकारात्मकरूपेण प्राप्तः । प्रत्येकस्य जैविकप्रतिकृतेः कृते लिपिड् संकेतः त्रयाणां स्वतन्त्रमापनानां माध्यिका भवति ।
यथा (31) इत्यत्र वर्णितं, Gas1-GFP अभिव्यक्तं कुर्वतीनां कोशिकानां (800×107) प्राकृतिकप्रतिरक्षावृष्टिः कृता । शुद्धं Gas1-GFP SDS-PAGE द्वारा पृथक् कृत्वा polyvinylidene fluoride (PVDF) झिल्लीयां स्थानान्तरितम्। एमाइड् ब्ल्याक् इत्यनेन पीवीडीएफ इत्यस्य रंगं कृत्वा प्रोटीनस्य दृश्यीकरणं कृतम् । Gas1-GFP पट्टिकां PVDF तः कटयित्वा मेथानोलेन 5 वारं तथा च एकवारं द्रव क्रोमैटोग्राफी-MS (LC-MS) ग्रेडजलेन प्रक्षालितम्। झिल्लीपट्टिकां 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), बफरेन 500μl नवविलग्नेन 1 M सोडियम नाइट्राइटमिश्रणेन च 37°C मध्ये 3 घण्टापर्यन्तं इन्क्यूबेशनं कृत्वा, लिपिडभागं Gas1-GFP तः मुक्तं भवति तथा च ग्लूकोसामाइन् तथा इनोसिटोल (51) मध्ये इनोसाइन् फॉस्फेट सेरामाइडस्य विमोचनं विलाइजितं भवति। तदनन्तरं झिल्लीपट्टिकां LC-MS ग्रेडजलेन चतुर्वारं प्रक्षाल्य कक्षतापमाने शोषयित्वा -८०°C मध्ये नाइट्रोजनवातावरणे विश्लेषणपर्यन्तं संगृहीतवती नियन्त्रणरूपेण प्रत्येकं प्रयोगाय पीवीडीएफ-झिल्लीयाः रिक्तनमूना उपयुज्यते स्म । ततः Gas1-GFP तः निष्कासितस्य लिपिड् इत्यस्य MS द्वारा यथा वर्णितं (50) विश्लेषणं कृतम् । संक्षेपेण, GPI-लिपिड युक्तानि PVDF पट्टिकाः 75μl नकारात्मक मोल्ड विलायक [क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (1:2) + 5 mM अमोनियम एसीटेट्] इत्यस्मिन् पुनः निलम्बितानि आसन् तथा च स्फिंगोलिपिड प्रजातिनां इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI)-MRM/MS विश्लेषणं (TSQ Vantage) पारितवन्तः। अस्मिन् सन्दर्भे MS-दत्तांशः ऋणात्मक-आयन-विधाने प्राप्तः ।
यथा पूर्वं उक्तं, जीपीआई लंगरस्य लिपिड् भागः [3H]-इनोसिटोल-लेबल् जीपीआई-एपी (16) इत्यस्मात् पृथक् कृतः । लिपिड्स् विलायकप्रणाली (55:45:10 क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-0.25% KCl) इत्यस्य उपयोगेन पतली-स्तर-क्रोमैटोग्राफी द्वारा पृथक् कृत्वा FLA-7000 (Fujifilm) इत्यस्य उपयोगेन दृश्यीकरणं कृतम्
Gas1-GFP (600×107) अभिव्यक्ताः कोशिका: TNE बफरेन सह TNE बफरेन द्विवारं प्रक्षालिताः, काचस्य मणिभिः च भग्नाः, ततः कोशिकामलिनमवशेषं काचमणिं च दूरीकर्तुं अपकेन्द्रीकृताः ततः उपरितनं १७,००० ग्रामेण ४ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं १ घण्टापर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणं कृतम् । गोलीं TNE इत्यस्मिन् प्रक्षाल्य 0.2% digitalis saponin युक्ते TNE इत्यस्मिन् 1 U PI-PLC (Invitrogen) इत्यनेन सह 37°C इत्यत्र 1 घण्टां यावत् इन्क्यूबेशनं कृतम्। एन्जाइम-उपचारस्य अनन्तरं ४ डिग्री सेल्सियस् मध्ये १७,००० ग्रामेषु १ घण्टापर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणेन झिल्लीं निष्कासितम् । Gas1-GFP इत्यस्य प्रतिरक्षा अवक्षेपणार्थं, सुपरनेटेंटं GFP-Trap_A (ChromoTek) इत्यनेन सह 4°C इत्यत्र रात्रौ यावत् इन्क्यूबेट् कृतम् । SDS-PAGE द्वारा पृथक्कृतं शुद्धं Gas1-GFP Coomassie brilliant blue इत्यनेन वर्णितम् आसीत् । Gas1-GFP-रञ्जनपट्टिका जलवाहिनीं परितः ग्रे-वर्णात् कटितम्, ततः आयोडोएसिटामाइड् इत्यनेन अल्काइलीकरणस्य अनन्तरं डाइथियोथ्रेइटोल् इत्यनेन न्यूनीकरणस्य च अनन्तरं ट्रिप्सिन् इत्यनेन सह जेल-अन्तर्गतं पाचनं कृतम् जीपीआई-ग्लाइकैन्स् इत्यनेन सह ट्रिप्टिक पेप्टाइड् तथा पेप्टाइड् निष्कर्षणं शुष्कं च कुर्वन्तु। शुष्कं पेप्टाइड् २० μl जले विलीनं कृतम् । LC मध्ये एकं भागं (8μl) इन्जेक्शनं कुर्वन्तु। विशिष्ट ढालस्थितौ पेप्टाइड् पृथक् कर्तुं ओक्टाडेसिलसिलेन (ODS) स्तम्भस्य (Develosil 300ODS-HG-5; आन्तरिकव्यासः 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) इत्यस्य उपयोगः कृतः चलचरणं विलायकं A (0.08% फॉर्मिक अम्लम्) तथा विलायक B (80% एसीटोनिट्राइलमध्ये 0.15% फॉर्मिक अम्लम्) भवति । एक्सेला एचपीएलसी प्रणाली (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) इत्यस्य उपयोगः कृतः यत् 55 ​​मिनिट् यावत् विलायकेन A इत्यनेन स्तम्भं 55 मिनिट् यावत् 50 μl min-1 इत्यस्य प्रवाहदरेण 5 मिनिट् यावत् इल्यूट् करणीयम्, ततः विलायक B इत्यस्य सान्द्रता 40% यावत् वर्धिता , संयुक्त राज्य अमेरिका)। इल्यूएट् इत्यस्य निरन्तरं ईएसआई आयनस्रोते प्रवेशः कृतः, तथा च जीपीआई-ग्लाइकैन्स् इत्यनेन सह ट्रिप्टिकपेप्टाइड्-पेप्टाइड्-इत्येतयोः विश्लेषणं LTQ Orbitrap XL (संकर-रेखीय-आयन-जाल-कक्षीय-मास-स्पेक्ट्रोमीटर्; Thermo Fisher Scientific) द्वारा कृतम् MS सेटअप इत्यस्मिन् केशिकास्रोतस्य वोल्टेजः ४.५ केवी इति निर्धारितः, स्थानान्तरणकेशिकायाः ​​तापमानं च ३००°C इति स्थापितः । केशिकावोल्टेजः, ट्यूबलेन्सवोल्टेजः च क्रमशः १५ वी, ५० वी इति निर्धारितः । MS आँकडा सकारात्मक आयन मोड (60,000 रिजोल्यूशन; 10 भाग प्रति मिलियन द्रव्यमानसटीकता) 300/m/z द्रव्यमान/आभार अनुपात (m/z) 3000 इत्यस्य द्रव्यमानपरिधिषु प्राप्तः MS/MS आँकडा LTQ Orbitrap XL [प्रथम 3 अङ्काः येषु आँकडा निर्भरं भवति, टकरावः प्रेरितविच्छेदः, इत्यस्मिन् आयनजालस्य माध्यमेन प्राप्तः भवति (CID)] ।
GROMACS (52) सॉफ्टवेयर तथा MARTINI 2 बलक्षेत्र (53-55) इत्येतयोः उपयोगेन एमडी अनुकरणं कृतम् । ततः CHARMM GUI झिल्लीनिर्मातृ (56, 57) इत्यस्य उपयोगेन डायोलियोइलफॉस्फेटिडाइलकोलाइन् (DOPC) तथा Cer C18 अथवा DOPC तथा Cer C26 युक्तस्य द्विस्तरस्य निर्माणं कृतम् Cer C26 इत्यस्य टोपोलॉजी तथा निर्देशांकाः स्फिंगोसाइन् पुच्छात् अतिरिक्तं मणिम् अपसारयित्वा DXCE इत्यस्मात् प्राप्ताः भवन्ति । द्विस्तरस्य संतुलनं कर्तुं अधोलिखितायाः प्रक्रियायाः उपयोगं कुर्वन्तु तथा च चालयन्तु, ततः Emp24 युक्तं प्रणालीं निर्मातुं प्रणाल्याः अन्तिमनिर्देशाङ्कानां उपयोगं कुर्वन्तु । खमीर Emp24 (अवशेषाः 173 तः 193) इत्यस्य ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेनस्य निर्माणं दृश्य एमडी (VMD) उपकरणस्य आणविकसंरचनायाः (58) उपयोगेन α-हेलिक्सरूपेण कृतम् आसीत् ततः आच्छादितलिपिड्स् निष्कास्य प्रोटीनस्य मोटे दानेदारीकरणं कृत्वा CHARMM GUI इत्यस्य उपयोगेन द्विस्तरस्य अन्तः प्रविष्टम् । अन्तिमप्रणाल्यां १२०२ DOPC तथा ३०२ Cer C26 अथवा 1197 DOPC तथा 295 Cer C18 तथा Emp24 सन्ति । प्रणालीं 0.150M सान्द्रतां यावत् आयनीकरणं कुर्वन्तु। द्विस्तरीयरचनानां कृते चत्वारि स्वतन्त्रप्रतिकृतयः कृताः ।
लिपिड् द्विस्तरं CHARMM GUI प्रक्रियायाः उपयोगेन संतुलितं भवति, यस्मिन् 405,000 चरणानां न्यूनीकरणं ततः संतुलनं च भवति, यत्र स्थितिप्रतिबन्धाः क्रमेण न्यूनीकृताः समाप्ताः च भवन्ति, तथा च समयपदं 0.005 ps तः 0.02 ps यावत् वर्धते संतुलनस्य अनन्तरं 0.02 ps इत्यस्य समयपदेन सह 6 μs उत्पादयति । Emp24 सम्मिलितस्य अनन्तरं, प्रणालीं न्यूनीकर्तुं संतुलनं च कर्तुं समाना CHARMM GUI प्रक्रियायाः उपयोगं कुर्वन्तु, ततः उत्पादनं 8 s यावत् चालयन्तु ।
सर्वेषां प्रणालीनां कृते संतुलनप्रक्रियायाः समये बेरेण्ड्सेन् बैरोस्टेट् (59) इत्यनेन दबावः नियन्त्रितः भवति, उत्पादनप्रक्रियायां च दाबः पारिनेलो-रहमान बैरोस्टेट् (60) इत्यनेन नियन्त्रितः भवति सर्वेषु सन्दर्भेषु औसतदाबः १ बारः भवति तथा च अर्धसमरूपदाबयुग्मनयोजनायाः उपयोगः भवति । संतुलनं उत्पादनप्रक्रियायां च क्रमशः प्रोटीन, लिपिड्, विलायककणानां तापमानं युग्मरूपेण गतिपुनमापनयुक्तस्य थर्मोस्टेट् (६१) इत्यस्य उपयोगः भवति सम्पूर्णे कार्यकाले लक्ष्यतापमानं ३१०K भवति । अ-बन्धनपरस्परक्रियायाः गणना 0.005 बफरसहिष्णुतायाः सह वर्लेट् योजनायाः उपयोगेन युग्मसूचीं जनयित्वा भवति । कूलम्बपदस्य गणना विक्रियाक्षेत्रस्य उपयोगेन भवति तथा च १.१ एनएम इत्यस्य कट-ऑफ-अन्तरस्य उपयोगेन भवति । वैण्डर् वाल्स पदं १.१ एनएम कट-ऑफ-दूरेण सह कट-ऑफ योजनायाः उपयोगं करोति, तथा च वर्लेट् कट-ऑफ योजना सम्भाव्य-भ्रमणस्य कृते उपयुज्यते (६२)
VMD इत्यस्य उपयोगेन DOPC फॉस्फेट-मणिः अथवा सेरामाइड-AM1 मणिः प्रोटीनस्य च मध्ये कटऑफ-तरङ्गदैर्घ्यं 0.7 nm भवति, प्रोटीनेन सह अन्तरक्रियां कुर्वतां लिपिड्-सङ्ख्यायाः गणना भवति निम्नलिखितसूत्रानुसारं (63) इत्यस्य अनुसारं क्षय-समृद्धि-कारकस्य गणनां कुर्वन्तु: DE कारकम् = (प्रोटीनमध्ये कुल-लिपिडस्य मात्रा 0.7) प्रोटीने 0.7 (कुल-लिपिडेषु Cer-मात्रा)
निवेदितं मूल्यं औसतरूपेण प्राप्यते, त्रुटिपट्टिकाः च SE इत्यस्य चत्वारि स्वतन्त्रप्रतियाः सन्ति । DE कारकस्य सांख्यिकीयमहत्त्वस्य गणना t test [(averageDE-factor-1)/SE] द्वारा भवति । एकपुच्छवितरणात् P मूल्यं गणयन्तु ।
GROMACS उपकरणस्य उपयोगः ट्रेसस्य अन्तिम 250 ns अन्तः Emp24 युक्तस्य प्रणाल्याः 2D पार्श्वघनत्वनक्शायाः गणनाय कृतः । सेरामाइडस्य संवर्धन/क्षयमानचित्रं प्राप्तुं Cer इत्यस्य घनत्वनक्शा Cer तथा DOPC इत्येतयोः मानचित्रस्य योगेन विभक्तं भवति, ततः शरीरे Cer इत्यस्य सान्द्रतायाः विभाजनं भवति स एव वर्णनक्शा स्केलः उपयुज्यते ।
अस्य लेखस्य पूरकसामग्रीणां कृते कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 पश्यन्तु
एषः क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-वाणिज्यिक-अनुज्ञापत्रस्य शर्तानाम् अन्तर्गतं वितरितः मुक्त-प्रवेश-लेखः अस्ति, यः कस्मिन् अपि माध्यमे उपयोगं, वितरणं, पुनरुत्पादनं च अनुमन्यते, यावत् अन्तिमः उपयोगः व्यावसायिकलाभार्थं न भवति तथा च आधारः अस्ति यत् मूलकार्यं सम्यक् अस्ति सन्दर्भः।
नोटः- वयं केवलं भवन्तं भवतः ईमेल-सङ्केतं प्रदातुम् याचयामः येन भवन्तः पृष्ठे अनुशंसिताः व्यक्तिः ज्ञास्यति यत् भवन्तः इच्छन्ति यत् ते ईमेल-पत्रं द्रष्टुम् इच्छन्ति तथा च एतत् स्पैम् नास्ति इति। वयं किमपि ईमेल-सङ्केतं न गृह्णीमः ।
एषः प्रश्नः भवान् आगन्तुकः अस्ति वा इति परीक्षितुं स्वयमेव स्पैम-प्रदानं निवारयितुं च उपयुज्यते ।
सोफिया रोड्रिग्ज-गल्लार्दो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना साबिडो-बोजो, अलेजांड्रो कोर्टेज · गोमेज (अलेजान्ड्रो कोर्टेस-गोमेज), अत्सुको इकेडा (अत्सुको इकेडा), वैलेरिया ज़ोनी (वैलेरिया ज़ोनी), औक्सिलियाडोरा एगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज -लिनेरो), सर्जियो लोपेज (सर्जियो लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अर्मन् (मिसाको अर्मन्), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकिरा, स्टीफनो फैनी, अकिहिको नाकानो, मैनुअल मुनिज
3D उच्च-संकल्प-वास्तविक-समय-प्रतिबिम्बनं चयनात्मक-निर्गम-स्थलेषु प्रोटीन-क्रमणार्थं सेरामाइड-शृङ्खला-दीर्घतायाः महत्त्वं प्रकाशयति ।
सोफिया रोड्रिग्ज-गल्लार्दो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना साबिडो-बोजो, अलेजांड्रो कोर्टेज · गोमेज (अलेजान्ड्रो कोर्टेस-गोमेज), अत्सुको इकेडा (अत्सुको इकेडा), वैलेरिया ज़ोनी (वैलेरिया ज़ोनी), औक्सिलियाडोरा एगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज -लिनेरो), सर्जियो लोपेज (सर्जियो लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अर्मन् (मिसाको अर्मन्), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकिरा, स्टीफनो फैनी, अकिहिको नाकानो, मैनुअल मुनिज
3D उच्च-संकल्प-वास्तविक-समय-प्रतिबिम्बनं चयनात्मक-निर्गम-स्थलेषु प्रोटीन-क्रमणार्थं सेरामाइड-शृङ्खला-दीर्घतायाः महत्त्वं प्रकाशयति ।
©2020 अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द एडवांसमेण्ट् आफ् साइंस। सर्वे अधिकाराः सुरक्षिताः। एएएएस HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef तथा COUNTER इत्येतयोः भागीदारः अस्ति । विज्ञान उन्नति ISSN 2375-2548.