लेखः “रोगजनकानाम् कीटानां च प्रतिरोधं सुदृढं करणं” इति शोधविषयस्य भागः अस्ति, सर्वे ५ लेखाः पश्यन्तु
कवकवनस्पतिरोगस्य परिगलनस्य कारणकारकः स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (Lib.) डी बैरी भिन्न-भिन्न-मेजबान-वनस्पतयः संक्रमितुं बहुस्तरीय-रणनीत्याः उपयोगं करोति अस्मिन् अध्ययने अन्येषां आवश्यकानां अमीनो अम्लानां संश्लेषणं उत्तेजयति इति गैर-प्रोटीन-अमीनो-अम्लस्य डायमाइन् एल-ओर्निथिन् इत्यस्य उपयोगः प्रस्तावितः अस्ति, यत् स्यूडोमोनास् स्क्लेरोटिओरम-जनितस्य श्वेतस्य सांचने Phaseolus vulgaris L. इत्यस्य आणविक-शारीरिक-जैव-रासायनिक-प्रतिक्रियां वर्धयितुं वैकल्पिक-प्रबन्धन-रणनीतिः अस्ति इन् विट्रो प्रयोगेषु ज्ञातं यत् एल-ओर्निथिन् इत्यनेन मात्रानिर्भररूपेण एस. अपि च, ग्रीनहाउस-स्थितौ श्वेत-ढालस्य तीव्रताम् महत्त्वपूर्णतया न्यूनीकर्तुं शक्नोति स्म । अपि च, एल-ओर्निथिन् इत्यनेन उपचारितवनस्पतयः वर्धिताः, येन सूचितं यत् एल-ओर्निथिनस्य परीक्षितसान्द्रता उपचारितवनस्पतयः कृते पादपविषाक्ताः न आसन् तदतिरिक्तं एल-ओर्निथिन् इत्यनेन गैर-एन्जाइमिक-एण्टीऑक्सिडेण्ट् (कुल-घुलनशील-फिनोलिक्स् तथा फ्लेवोनोइड्) तथा एन्जाइमेटिक-एण्टीऑक्सिडेण्ट् (कैटालेज् (CAT), पेरोक्साइडेज (POX), तथा च पॉलीफेनोल् आक्सीडेज् (PPO)) इत्येतयोः अभिव्यक्तिः वर्धिता, तथा च एण्टीऑक्सिडेण्ट्-सम्बद्धानां त्रयाणां जीनानां (PvCAT1, PvSOD, तथा PvGR) अभिव्यक्तिः वर्धिता अपि च, सिलिको-विश्लेषणेन एस. (PlOAH) कार्यात्मकविश्लेषणस्य, संरक्षितक्षेत्रस्य, टोपोलॉजीस्य च दृष्ट्या । रोचकं तत् अस्ति यत् आलू डेक्स्ट्रोज शोरबा (PDB) माध्यमे L-ornithine इत्यस्य योजनेन S. sclerotiorum mycelia इत्यस्मिन् SsOAH जीनस्य अभिव्यक्तिः महत्त्वपूर्णतया न्यूनीभूता तथैव एल-ओर्निथिनस्य बहिर्जातप्रयोगेन उपचारितवनस्पतयः एकत्रितेषु कवकमाइसेलियमेषु SsOAH जीनस्य अभिव्यक्तिः महती न्यूनीभूता । अन्ते एल-ओर्निथिन्-प्रयोगेन पीडीबी-माध्यमेषु संक्रमितपत्रेषु च आक्सालिक-अम्ल-स्रावस्य महती न्यूनता अभवत् । निष्कर्षतः एल-ओर्निथिन् रेडॉक्स-स्थितिं निर्वाहयितुम् अपि च संक्रमित-वनस्पतयः रक्षा-प्रतिक्रियां वर्धयितुं प्रमुखा भूमिकां निर्वहति । अस्य अध्ययनस्य परिणामाः श्वेतस्य ढालस्य नियन्त्रणार्थं अभिनव-पर्यावरण-अनुकूल-पद्धतीनां विकासे सहायकाः भवितुम् अर्हन्ति तथा च ताम्बूल-उत्पादने अन्यसस्यानां च उपरि तस्य प्रभावं न्यूनीकर्तुं साहाय्यं कर्तुं शक्नुवन्ति
श्वेत ढालः, मृतकवकस्य Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary इत्यस्य कारणेन उत्पद्यमानः, एकः विनाशकारी, उपजं न्यूनीकर्तुं रोगः अस्ति यः वैश्विकबीन (Phaseolus vulgaris L.) उत्पादनाय गम्भीरं खतराम् उत्पद्यते (Bolton et al., 2006) स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमः नियन्त्रणं कर्तुं कठिनतमेषु मृदाजनितकवकवनस्पतिरोगजनकेषु अन्यतमः अस्ति, यस्य 600 तः अधिकानां वनस्पतिजातीनां विस्तृत मेजबानपरिधिः अस्ति तथा च अविशिष्टरीत्या मेजबानस्य ऊतकानाम् शीघ्रं मैसेरेट् कर्तुं क्षमता अस्ति (Liang and Rollins, 2018) प्रतिकूलपरिस्थितौ अयं स्वजीवनचक्रस्य गम्भीरचरणं गच्छति, मृत्तिकायां कृष्णवर्णीयकठिन, बीजसदृशसंरचनानां रूपेण अथवा संक्रमितवनस्पतयः माइसेलियमस्य अथवा काण्डपिथस्य श्वेतस्य, मृदुवृद्धेः रूपेण दीर्घकालं यावत् सुप्तः तिष्ठति (Schwartz et al., 2005) एस.स्क्लेरोटिओरमः स्क्लेरोटिया-निर्माणं कर्तुं समर्थः भवति, येन संक्रमितक्षेत्रेषु दीर्घकालं यावत् जीवितुं शक्यते, रोगस्य समये च स्थातुं शक्यते (Schwartz et al., 2005) स्क्लेरोटिया पोषकद्रव्यैः समृद्धाः सन्ति, दीर्घकालं यावत् मृत्तिकायां स्थातुं शक्नुवन्ति, अनन्तरं संक्रमणानां कृते प्राथमिकटीकारूपेण कार्यं कुर्वन्ति (Schwartz et al., 2005) अनुकूलपरिस्थितौ स्क्लेरोटिया अंकुरणं भवति, वायुवाहितबीजाणुः च उत्पादयति ये पादपस्य सर्वान् भूमौ उपरिभागान् संक्रमयितुं शक्नुवन्ति, यत्र पुष्पाणि, काण्डानि, फलानि वा सन्ति (Schwartz et al., 2005)
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमः स्वस्य मेजबानवनस्पतयः संक्रमितुं बहुस्तरीयरणनीत्याः उपयोगं करोति, यत्र स्क्लेरोटिया-अङ्कुरणात् लक्षणविकासपर्यन्तं समन्वितघटनानां श्रृङ्खला भवति प्रारम्भे एस. ततः कवकः वनस्पतिकोशिकाभित्तिः पीएच नियन्त्रयितुं, एन्जाइमिक-अवघटनं ऊतक-आक्रमणं च प्रवर्धयितुं (Hegedus and Rimmer, 2005), मेजबान-वनस्पतिस्य आक्सीडेटिव-विस्फोटं दमनार्थं च ओक्सालिक-अम्लम्, विषाणुताकारकं स्रावयति इयं अम्लीकरणप्रक्रिया वनस्पतिकोशिकाभित्तिं दुर्बलं करोति, यत् कवककोशिकाभित्तिं अपघटनक एन्जाइम्स् (CWDEs) इत्यस्य सामान्यस्य कुशलस्य च संचालनाय अनुकूलं वातावरणं प्रदाति, येन रोगजनकः भौतिकबाधां दूरीकर्तुं मेजबान ऊतकयोः प्रवेशं कर्तुं शक्नोति (Marciano et al., 1983) एकदा प्रवेशं कृत्वा एस. क्षतानां तथा हाइफाल् चटाईनां प्रगतिः श्वेतस्य ढालस्य लक्षणं जनयति (Hegedus and Rimmer, 2005) । इत्थं च, मेजबान-वनस्पतयः प्रतिरूप-परिचय-ग्राहकानाम् (PRRs) माध्यमेन रोगजनक-सम्बद्धान् आणविक-प्रतिमानं (PAMPs) ज्ञायन्ते, येन संकेत-घटनानां श्रृङ्खला उत्पद्यन्ते, ये अन्ततः रक्षा-प्रतिक्रियाः सक्रियं कुर्वन्ति
दशकशः रोगनियन्त्रणप्रयत्नानाम् अभावेऽपि रोगजनकस्य प्रतिरोधकशक्तिः, जीवितः, अनुकूलता च इति कारणेन अन्येषु वाणिज्यिकसस्येषु इव ताम्बूलेषु पर्याप्तप्रतिरोधीजर्मप्लाज्मस्य अभावः वर्तते अतः रोगप्रबन्धनम् अत्यन्तं चुनौतीपूर्णं भवति तथा च एकीकृता, बहुपक्षीयरणनीतिः आवश्यकी भवति यस्मिन् सांस्कृतिकप्रथानां, जैविकनियन्त्रणस्य, रासायनिककवकनाशकानां च संयोजनं भवति (O'Sullivan et al., 2021)। श्वेतस्य ढालस्य रासायनिकनियन्त्रणं सर्वाधिकं प्रभावी भवति यतोहि कवकनाशकाः सम्यक् समये च प्रयुक्ते रोगस्य प्रसारं प्रभावीरूपेण नियन्त्रयितुं, संक्रमणस्य तीव्रताम् न्यूनीकर्तुं, उपजहानिः न्यूनीकर्तुं च शक्नुवन्ति तथापि, कवकनाशकानाम् अत्यधिकप्रयोगः, अतिनिर्भरता च एस. अतः पर्यावरणसौहृदविकल्पानां अन्वेषणं सर्वोच्चप्राथमिकता अभवत् ।
पोलियामाइन्स् (PAs), यथा पुट्रेसिन्, स्पर्मिडिन्, स्पर्माइन, तथा कैडावेरिन्, मृदाजनितवनस्पतिरोगजनकानाम् विरुद्धं आशाजनकविकल्परूपेण कार्यं कर्तुं शक्नुवन्ति, येन खतरनाकरासायनिककवकनाशकानाम् उपयोगं पूर्णतया वा आंशिकरूपेण वा न्यूनीकरोति (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024)। उच्चतरपौधेषु, पीए अनेकशारीरिकप्रक्रियासु सम्मिलिताः भवन्ति, यत्र कोशिकाविभाजनं, भेदभावः, अजैविकजैविकतनावानां प्रतिक्रिया च सन्ति, परन्तु एतेषु एव सीमिताः न सन्ति (Killiny and Nehela, 2020)। ते एण्टीऑक्सिडेण्ट् इत्यस्य रूपेण कार्यं कर्तुं शक्नुवन्ति, प्रतिक्रियाशील-आक्सीजन-प्रजातीनां (ROS) स्केवेन्ज-करणे सहायतां कर्तुं शक्नुवन्ति, रेडॉक्स-होमोस्टेसिस-इत्येतत् निर्वाहयितुं शक्नुवन्ति (Nehela and Killiny, 2023), रक्षा-सम्बद्धान् जीनान् प्रेरयितुं शक्नुवन्ति (Romero et al., 2018), विविध-चयापचय-मार्गान् नियन्त्रयितुं शक्नुवन्ति (Nehela and Killiny, 2023), अन्तःजातीय-फाइटोहार्मोन-संतुलनं कर्तुं शक्नुवन्ति (Nehela and Killiny, 2023) 2019), प्रणालीगतं अधिग्रहीतप्रतिरोधं (SAR) स्थापयति, तथा च पौधा-रोगजनकपरस्परक्रियाः नियन्त्रयन्ति (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022)। ज्ञातव्यं यत् वनस्पतिरक्षायां पीए-विशिष्टतन्त्राणि भूमिकाश्च वनस्पतिजातीनां, रोगजनकानाम्, पर्यावरणस्य च परिस्थितेः आधारेण भिन्नाः भवन्ति पौधेषु सर्वाधिकं प्रचुरं पीए आवश्यकं पॉलीअमाइन् एल-ओर्निथिन् (Killiny and Nehela, 2020) इत्यस्मात् जैवसंश्लेषितं भवति ।
एल-ओर्निथिन् वनस्पतिवृद्धौ विकासे च बहुविधां भूमिकां निर्वहति । उदाहरणार्थं पूर्वाध्ययनेन ज्ञातं यत् चावलेषु (Oryza sativa) ऑर्निथिन् नाइट्रोजनपुनःप्रयोगेन (Liu et al., 2018), चावलस्य उपजः, गुणवत्ता च सुगन्धः (Lu et al., 2020), जलतनावप्रतिक्रिया (Yang et al., 2000) च सह सम्बद्धः भवितुम् अर्हति अपि च, एल-ओर्निथिनस्य बहिर्जातीयप्रयोगेन शर्करा चुकन्दर (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) इत्यस्मिन् सूखा सहिष्णुतायां महत्त्वपूर्णतया वृद्धिः अभवत् तथा च प्याज (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) तथा काजू (Anacardium occidentale) इत्यस्मिन् नमकस्य तनावः न्यूनीकृतः पौधे (दा रोचा एट अल., 2012)। अजैविकतनावरक्षायां एल-ओर्निथिनस्य सम्भाव्यभूमिका उपचारितवनस्पतिषु प्रोलिनसञ्चये तस्य संलग्नतायाः कारणेन भवितुम् अर्हति । उदाहरणार्थं, प्रोलाइन चयापचयेन सम्बद्धाः जीनाः, यथा ऑर्निथिन् डेल्टा एमिनोट्रांसफरेज् (डेल्टा-OAT) तथा प्रोलिन् डिहाइड्रोजनेज (ProDH1 तथा ProDH2) जीनाः, पूर्वं गैर-मेजबान-स्यूडोमोनास् सिरिन्गे-उपभेदानाम् (Senthil-Kumar and मैसूर, २०१२). अपरपक्षे रोगजनकवृद्ध्यर्थं कवकस्य ऑर्निथिन् डिकार्बोक्जिलेज् (ODC) आवश्यकं भवति (Singh et al., 2020) । Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via host-induced gene silencing (HIGS) इत्यनेन टमाटरस्य पौधानां Fusarium wilt प्रतिरोधं महत्त्वपूर्णतया वर्धितम् (Singh et al., 2020)। परन्तु पादपरोगजनकानाम् इत्यादीनां जैविकतनावानां विरुद्धं बहिर्जातीय-ओर्निथिन्-प्रयोगस्य सम्भाव्यभूमिकायाः ​​सम्यक् अध्ययनं न कृतम् अस्ति । अतः अपि महत्त्वपूर्णं यत्, रोगप्रतिरोधस्य उपरि ऑर्निथिनस्य प्रभावः, तत्सम्बद्धेषु जैवरासायनिकशारीरिकघटनासु च बहुधा अननुसन्धानं कृतम् अस्ति ।
फलानां S. sclerotiorum संक्रमणस्य जटिलतां अवगन्तुं प्रभावी नियन्त्रणरणनीतिविकासाय महत्त्वपूर्णम् अस्ति । अस्मिन् अध्ययने अस्माकं लक्ष्यं आसीत् यत् स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम संक्रमणस्य प्रति फलानां पादपानां रक्षातन्त्रं प्रतिरोधं च वर्धयितुं प्रमुखकारकरूपेण डायमाइन् एल-ओर्निथिनस्य सम्भाव्यभूमिकायाः ​​पहिचानं करणीयम्। वयं परिकल्पयामः यत्, संक्रमितवनस्पतयः रक्षाप्रतिक्रियाः वर्धयितुं अतिरिक्तं, एल-ओर्निथिन् रेडॉक्स-स्थितिं निर्वाहयितुम् अपि प्रमुखां भूमिकां निर्वहति वयं प्रस्तावयामः यत् एल-ओर्निथिनस्य सम्भाव्यप्रभावाः एंजाइमी-अ-एन्जाइमिक-एण्टीऑक्सिडेण्ट्-रक्षा-तन्त्रस्य नियमनेन सह सम्बद्धाः सन्ति तथा च कवक-रोगजनकता/विषाणुताकारकाणां तथा तत्सम्बद्धप्रोटीनानां च हस्तक्षेपेण सह सम्बद्धाः सन्ति एल-ओर्निथिनस्य एषा द्वयात्मका कार्यक्षमता श्वेतस्य फफून्दस्य प्रभावं न्यूनीकर्तुं सामान्यफलसस्यानां अस्य शक्तिशालिनः कवकरोगजनकस्य प्रतिरोधं वर्धयितुं च स्थायिरणनीत्याः आशाजनकं उम्मीदवारं करोति। वर्तमान अध्ययनस्य परिणामाः श्वेतस्य ढालस्य नियन्त्रणार्थं, फलानां उत्पादनस्य उपरि तस्य प्रभावं न्यूनीकर्तुं च अभिनव-पर्यावरण-अनुकूल-पद्धतीनां विकासे सहायकाः भवितुम् अर्हन्ति
अस्मिन् अध्ययने सामान्यबीजस्य संवेदनशीलव्यापारिकप्रकारः गिजा ३ (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) इति प्रयोगसामग्रीरूपेण उपयोगः कृतः । स्वस्थबीजानि फलीसंशोधनविभागेन, क्षेत्रसस्यसंशोधनसंस्थायाः (FCRI), कृषिसंशोधनकेन्द्रेन (ARC), मिस्रदेशेन कृपया प्रदत्तानि। ग्रीनहाउस-स्थितौ (25 ± 2 °C, सापेक्षिक-आर्द्रता 75 ± 1%, 8 घण्टा प्रकाशः/16 घण्टाः अन्धकारः) एस. रोपणानन्तरं (DPS) ७–१० दिवसेषु अंकुराः पतलाः कृताः येन प्रत्येकस्मिन् घटे केवलं द्वौ अंकुरौ एकरूपवृद्धौ, त्रीणि पूर्णविस्तारितपत्राणि च त्यजन्ति स्म सर्वेषां कुम्भितवनस्पतयः सप्ताहद्वये एकवारं जलं दत्त्वा दत्तस्य प्रकारस्य अनुशंसितदरेण मासिकं निषेचनं कृतवन्तः ।
L-ornithinediamine ((+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) इत्यस्य ५०० mg/L सान्द्रतां निर्मातुं प्रथमं ५० mg/L 100 mL बाँझ आसुतजलस्य मध्ये विलीनं कृतम् ततः स्टॉक-विलयनं क्षीणं कृत्वा अनन्तरं प्रयोगेषु उपयुज्यते स्म । संक्षेपेण, एल-ओर्निथिन् सान्द्रतायाः (१२.५, २५, ५०, ७५, १००, तथा १२५ मिग्रा/लीटर) षट् श्रृङ्खलाः इन् विट्रो इत्यत्र परीक्षणं कृतम् । तदतिरिक्तं बाँझ आसुतजलस्य उपयोगः नकारात्मकनियन्त्रणरूपेण (Mock) कृतः तथा च व्यावसायिककवकनाशकस्य “Rizolex-T” 50% आर्द्रयोग्यचूर्णस्य (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zaayat कीटनाशकाः तथा रसायनकम्पनी, Kafr El Zaayat, Gharbia Governorate, Egypt) सकारात्मकनियन्त्रणरूपेण उपयुज्यते स्म वाणिज्यिककवकनाशकस्य “Rizolex-T” इत्यस्य परीक्षणं पञ्चसान्द्रतासु (2, 4, 6, 8 तथा 10 mg/L) इन् विट्रो इत्यत्र कृतम् ।
श्वेतसफस्य (आक्रमणस्य दरः: १०–३०%) विशिष्टलक्षणं दर्शयन्तः सामान्यबीनकाण्डस्य फलानां च नमूनानि वाणिज्यिककृषिक्षेत्रेभ्यः एकत्रितानि आसन् । यद्यपि संक्रमितवनस्पतिसामग्रीणां अधिकांशं जाति/विविधता (संवेदनशीलव्यापारिकविविधता गीजा ३) द्वारा चिह्नितं तथापि अन्ये विशेषतः स्थानीयविपण्यतः प्राप्ताः अज्ञातजातीयाः आसन् संगृहीतसंक्रमितसामग्रीणां प्रथमं ०.५% सोडियमहाइपोक्लोराइटविलयनेन ३ निमेषपर्यन्तं पृष्ठीयकीटाणुनाशकं कृत्वा, ततः बाँझ-आसुतजलेन अनेकवारं प्रक्षालितं, अतिरिक्तजलं दूरीकर्तुं बाँझ-छिद्रकपत्रेण शुष्कं पोंछितम् ततः संक्रमित-अङ्गानाम् मध्य-उतकात् (स्वस्थ-संक्रमित-उतकयोः मध्ये) लघु-लघु-खण्डेषु काट्य, आलू-डेक्स्ट्रोज-अगर (PDA)-माध्यमे संवर्धितं कृत्वा 25 ± 2 °C-पर्यन्तं 12 घण्टा-प्रकाश/12 घण्टा-अन्धकार-चक्रेण 5 दिवसान् यावत् इन्क्यूबेट् कृत्वा स्क्लेरोटिया-निर्माणं उत्तेजितम् मिश्रित-दूषित-संस्कृतीभ्यः कवक-पृथक्करणानाम् अपि शुद्ध्यर्थं माइसेलियम-अग्र-पद्धतेः उपयोगः कृतः । शुद्धं कवकपृथक्करणं प्रथमं तस्य सांस्कृतिकरूपवैज्ञानिकलक्षणानाम् आधारेण चिह्नितं ततः सूक्ष्मविशेषतानां आधारेण एस. अन्ते कोचस्य धारणानां पूर्तये सर्वेषां शुद्धानां पृथक्करणानाम् रोगजनकतायाः परीक्षणं संवेदनशीलसामान्यबीजजातेः गिजा ३ इत्यस्य उपरि कृतम् ।
तदतिरिक्तं, अत्यन्तं आक्रामकं एस. Baturo-Ciesniewska et al., 2017. संक्षेपेण, आलू डेक्स्ट्रोज शोरबा (PDB) इत्यस्मिन् पृथक्करणं संवर्धितं कृत्वा 25 ± 2 °C इत्यत्र 5–7 दिवसपर्यन्तं इन्क्यूबेट् कृतम्। ततः कवकमाइसेलियमं सङ्गृह्य पनीरवस्त्रेण छानयित्वा बाँझजलेन द्विवारं प्रक्षाल्य बाँझछनकपत्रेण शोषितम् । जीनोमिक डीएनए इत्यस्य पृथक्करणं त्वरित-डीएनए TM फंगल/बैक्टीरियल मिनीप्रेप् किट (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) इत्यस्य उपयोगेन कृतम् आसीत् । ततः ITS rDNA क्षेत्रं विशिष्टस्य प्राइमरयुग्मस्य ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; अपेक्षित आकारः: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ) इत्यस्य उपयोगेन प्रवर्धितम् शुद्धं पीसीआर उत्पादं अनुक्रमणार्थं प्रस्तुतम् (बीजिंग आओके डिंगशेंग बायोटेक्नोलॉजी कंपनी, लिमिटेड)। ITS rDNA अनुक्रमाणां अनुक्रमणं द्विदिशारूपेण Sanger अनुक्रमणपद्धतेः उपयोगेन कृतम् । ततः संयोजितप्रश्नक्रमाणां तुलना BLASTn सॉफ्टवेयरस्य उपयोगेन GenBank तथा National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) इत्यस्मिन् नवीनतमदत्तांशैः सह कृता क्वेरी अनुक्रमस्य तुलना एनसीबीआई जेनबैंक (पूरकसारणी S1) इत्यस्मिन् नवीनतमदत्तांशतः प्राप्तैः अन्यैः 20 एस. अधिकतमसंभावनापद्धतेः सामान्यसमय-प्रतिवर्तनीयन्यूक्लिओटाइडप्रतिस्थापनप्रतिरूपस्य च उपयोगेन विकासात्मकविश्लेषणं कृतम् (Nei and Kumar, 2000)। उच्चतमः लॉग-संभावनायुक्तः वृक्षः दर्शितः अस्ति । अनुमानात्मकसन्धानार्थं प्रारम्भिकवृक्षस्य चयनं प्रतिवेशिनः-संयोजनस्य (NJ) वृक्षस्य (Kumar et al., 2024) अधिकतमपारसिमोनी (MP) वृक्षस्य च मध्ये अधिकलॉग-संभावनायुक्तस्य वृक्षस्य चयनेन भवति एनजे वृक्षस्य निर्माणं सामान्यसमय-प्रतिवर्तनीयप्रतिरूपस्य उपयोगेन गणितस्य युग्मवारदूरतामात्रिकायाः ​​उपयोगेन कृतम् (Nei and Kumar, 2000) ।
एल-ओर्निथिनस्य जीवाणुनाशकस्य “रिजोलेक्स-टी” इत्यस्य च जीवाणुनाशकस्य क्रियाशीलता अगरप्रसारणपद्धत्या इन् विट्रो इत्यत्र निर्धारिता । विधिः L-ornithine (500 mg/L) इत्यस्य स्टॉक घोलस्य समुचितमात्रायां गृहीत्वा PDA पोषकमाध्यमस्य 10 ml इत्यनेन सह सम्यक् मिश्रयित्वा क्रमशः 12.5, 25, 50, 75, 100 तथा 125 mg/L इत्यस्य अन्तिमसान्द्रतायुक्तं घोलं तैयारं कुर्वन्तु। कवकनाशकस्य “रिजोलेक्स-टी” (२, ४, ६, ८ तथा १० मिग्रा/लीटर) इत्यस्य पञ्च सान्द्रताः, बाँझ आसुतजलं च नियन्त्रणरूपेण उपयुज्यते स्म । माध्यमस्य ठोसत्वस्य अनन्तरं स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमसंस्कृतेः नवनिर्मितं माइसेलियमप्लगं, ४ मि.मी.व्यासं, पेट्री-पक्वान्नस्य केन्द्रे स्थानान्तरितम्, २५±२°C-पर्यन्तं च संवर्धितं यावत् माइसेलियमः सम्पूर्णं नियन्त्रण-पेट्री-पात्रं न आच्छादयति, तदनन्तरं कवकस्य वृद्धिः अभिलेखिता समीकरण 1 इत्यस्य उपयोगेन S. sclerotiorum इत्यस्य रेडियलवृद्धेः प्रतिशतनिरोधस्य गणनां कुर्वन्तु:
प्रयोगः द्विवारं पुनः कृतः, प्रत्येकस्य नियन्त्रण/प्रयोगसमूहस्य कृते षट् जैविकप्रतिकृतयः, प्रत्येकस्य जैविकप्रतिकृतेः कृते पञ्च घटाः (प्रतिघटं द्वौ वनस्पतौ) च प्रयोगात्मकपरिणामानां सटीकता, विश्वसनीयता, पुनरुत्पादनक्षमता च सुनिश्चित्य प्रत्येकस्य जैविकप्रतिकृतिस्य द्विवारं (द्वौ तकनीकीप्रतिकृतौ) विश्लेषणं कृतम् तदतिरिक्तं अर्ध-अधिकतमनिरोधात्मकसान्द्रतायाः (IC50) तथा IC99 (Prentice, 1976) च गणनाय प्रोबिट् रिग्रेशन विश्लेषणस्य उपयोगः कृतः ।
ग्रीनहाउस-स्थितौ एल-ओर्निथिनस्य क्षमतायाः मूल्याङ्कनार्थं क्रमशः द्वौ घटप्रयोगौ कृतौ । संक्षेपेण, घटाः निष्फलितमृत्तिका-वालुका-मृत्तिका (३:१) पूरयित्वा एस. प्रथमं, एस.स्क्लेरोटियोरमस्य (आइसोलेट #3) अत्यन्तं आक्रामकं पृथक्करणं एकं स्क्लेरोटियमं आर्धेन काट्य, पीडीए इत्यत्र मुखं अधः स्थापयित्वा, 25°C इत्यत्र नित्यं अन्धकारे (24 घण्टा) 4 दिवसपर्यन्तं इन्क्यूबेशनं कृत्वा माइसेलियमवृद्धिं उत्तेजितुं संवर्धितम्। ततः अग्रभागात् चत्वारि ५ मि.मी.व्यासस्य अगरप्लग्स् गृहीत्वा गोधूमस्य तण्डुलस्य च चोकरस्य (१:१, v/v) बाँझमिश्रणस्य १०० ग्रामस्य टीकाकरणं कृत्वा सर्वाणि फ्लास्काः १२ घण्टाप्रकाश/१२ घण्टा अन्धकारचक्रस्य अन्तर्गतं २५ ± २ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं ५ दिवसपर्यन्तं इन्क्यूबेट् कृत्वा स्क्लेरोटियानिर्माणं उत्तेजितवन्तः मृत्तिकां योजयितुं पूर्वं सर्वेषां फ्लास्कानाम् सामग्रीं सम्यक् मिश्रितं यत् एकरूपता सुनिश्चिता भवति स्म । ततः, रोगजनकानाम् नित्यसान्द्रता सुनिश्चित्य प्रत्येकस्मिन् घटे उपनिवेशीकरणकोषमिश्रणस्य १०० ग्रामं योजितम् । टीकाकृतेषु घटेषु कवकवृद्धिं सक्रियं कर्तुं जलं दत्त्वा ७ दिवसपर्यन्तं ग्रीनहाउसस्थितौ स्थापितं ।
ततः प्रत्येकं घटे गीजा ३ प्रकारस्य पञ्च बीजानि रोपितानि । एल-ओर्निथिन् तथा कवकनाशकेन रिजोलेक्स-टी इत्यनेन उपचारितघटानां कृते प्रथमं निष्फलं बीजं क्रमशः प्रायः २५० मिग्रा/लीटर तथा ५० मिग्रा/लीटर इत्यस्य अन्तिम IC99 सान्द्रतायाः द्वयोः यौगिकयोः जलीयविलयने द्वौ घण्टां यावत् सिक्तं कृत्वा ततः बोयनात् पूर्वं एकघण्टां यावत् वायुना शुष्कं कृतम् अपरं तु नकारात्मकनियन्त्रणरूपेण बीजानि बाँझ-आसुतजलेन सिक्ताः आसन् । १० दिवसेभ्यः अनन्तरं प्रथमजलप्रदानात् पूर्वं अंकुराः कृशाः कृताः, प्रत्येकस्मिन् घटे केवलं द्वौ सुव्यवस्थितौ अंकुरौ अवशिष्टौ । तदतिरिक्तं एस. नियन्त्रणसंस्थानानि अपि तथैव क्षतिग्रस्ताः आसन् तथा च व्रणमध्ये समानमात्रायां (०.५ ग्राम) बाँझ, अउपनिवेशित चोकरमिश्रणं स्थापयित्वा उच्चार्द्रतायां निर्वाहितं यत् रोगविकासाय वातावरणस्य अनुकरणं भवति तथा च उपचारसमूहानां मध्ये स्थिरतां सुनिश्चितं भवति स्म
उपचारविधिः : बीन-अङ्कुरेषु मृत्तिकायाः ​​सिञ्चनं कृत्वा एल-ओर्निथिन् (२५० मिग्रा/लीटर) अथवा कवकनाशकस्य रिजोलेक्स-टी (५० मिग्रा/लीटर) इत्यस्य ५०० मिलीलीटरजलीयविलयनेन जलं दत्तम्, ततः १० दिवसानां अन्तरालेन त्रिवारं पुनः उपचारः कृतः प्लेसिबो-उपचारितनियन्त्रणानां ५०० मिलिलीटरबाँझ-आसुतजलेन सिञ्चनं कृतम् । सर्वे उपचाराः ग्रीनहाउस-स्थितौ (25 ± 2°C, 75 ± 1% सापेक्षिक-आर्द्रता, 8 घण्टा-प्रकाशः/16 घण्टा-अन्धकारस्य च प्रकाशकालः) कृताः सर्वेषां घटानां पखवाडिकरूपेण जलं दत्तं तथा च विशिष्टविविधतायाः अनुशंसानाम् अनुसारं निर्मातुः निर्देशानुसारं च पर्णस्प्रेकरणेन ३–४ ग्राम/लीटरसान्द्रतायां संतुलितेन एनपीके उर्वरकेन (२०-२०-२०, ३.६% गन्धकेन सह टीई सूक्ष्मतत्त्वैः सह; जैन बीज, मिस्र) मासिकरूपेण उपचारः कृतः यद्यपि अन्यथा न उक्तं, पूर्णतया विस्तारितानि परिपक्वपत्राणि (ऊर्ध्वतः द्वितीयं तृतीयं च पत्रं) 72 घण्टे उपचारोत्तरे (hpt) एकत्रितानि, समरूपीकृत्य, पूलीकृत्य -80 °C इत्यत्र संग्रहीताः, अग्रे विश्लेषणार्थं च, परन्तु अत्र सीमितं न, आक्सीडेटिव तनावसूचकानाम् स्थानिकरूपेण ऊतकरासायनिकस्थानीकरणं, लिपिड पेरोक्साइडेशनं, एंजाइमेटिकं तथा गैर-एन्जाइमेटिकं च समाविष्टम् एण्टीऑक्सिडेण्ट् तथा जीन अभिव्यक्ति।
श्वेत मोल्ड संक्रमण तीव्रता टीकाकरणस्य (dpi) अनन्तरं साप्ताहिकरूपेण 1–9 (पूरकसारणी S2) स्केलस्य उपयोगेन मूल्याङ्कनं कृतम् यत् Teran et al. (2006) इति । संक्षेपेण, अन्तरग्रन्थिषु, ग्रन्थिषु च क्षतानां प्रगतिम् अनुसृत्य टीकाकरणस्थानात् आरभ्य ताम्बूलवृक्षाणां काण्डानां शाखानां च परीक्षणं कृतम् ततः टीकाकरणबिन्दुतः काण्डस्य अथवा शाखायाः सह दूरतमबिन्दुपर्यन्तं क्षतस्य दूरी मापनं कृत्वा क्षतस्य स्थानस्य आधारेण १–९ इति स्कोरः नियुक्तः, यत्र (१) टीकाकरणबिन्दुसमीपे कोऽपि दृश्यमानः संक्रमणः नास्ति इति सूचितः तथा च (२–९) क्षतस्य आकारे क्रमिकवृद्धिः, नोड्स/अन्तर्नोड्-सङ्गमे प्रगतिः च सूचितवती (पूरकसारणी S2) ततः सूत्र 2 इत्यस्य उपयोगेन श्वेतस्य ढालस्य संक्रमणस्य तीव्रता प्रतिशतं परिवर्तिता:
तदतिरिक्तं रोगप्रगतिवक्रस्य (AUDPC) अन्तर्गतक्षेत्रस्य गणना सूत्रस्य (Shaner and Finney, 1977) इत्यस्य उपयोगेन कृता, यत् समीकरणस्य 3 इत्यस्य उपयोगेन सामान्यबीनस्य श्वेतसड़ने (Chauhan et al., 2020) अद्यतने अनुकूलितं कृतम् आसीत्:
यत्र Yi = ti समये रोगस्य तीव्रता, Yi+1 = अग्रिमसमये ti+1 इत्यत्र रोगस्य तीव्रता, ti = प्रथममापनस्य समयः (दिनेषु), ti+1 = अग्रिममापनस्य समयः (दिनेषु), n = समयबिन्दवः अथवा अवलोकनबिन्दवः कुलसंख्या। वनस्पति-उच्चता (से.मी.), प्रति-वनस्पति-शाखानां संख्या, प्रति-वनस्पति-पत्राणां संख्या च सहितं बीन-वनस्पति-वृद्धि-मापदण्डाः सर्वेषु जैविक-प्रतिकृतिषु २१ दिवसान् यावत् साप्ताहिकरूपेण अभिलेखिताः आसन्
प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतौ उपचारस्य अनन्तरं ४५ दिने (अन्तिमचिकित्सायाः १५ दिवसेषु) पत्रस्य नमूनानि (ऊर्ध्वतः द्वितीयं तृतीयं च पूर्णतया विकसितानि पत्राणि) एकत्रितानि आसन् प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतिं पञ्च घटाः (प्रतिघटं द्वौ वनस्पतौ) आसीत् । अन्धकारे ४ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं ८०% एसीटोनस्य उपयोगेन प्रकाशसंश्लेषकवर्णकानाम् (क्लोरोफिल् ए, क्लोरोफिल् बी तथा कैरोटीनोइड्स्) निष्कर्षणार्थं प्रायः ५०० मिलिग्रामं मर्दितस्य ऊतकस्य उपयोगः कृतः २४ घण्टानां अनन्तरं नमूनानां अपकेन्द्रीकरणं कृत्वा (Lichtenthaler, 1987) इत्यस्य पद्धत्या UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् (Shimadzu Corporation, Japan) इत्यस्य उपयोगेन क्लोरोफिल् ए, क्लोरोफिल् बी तथा कैरोटीनोइड् सामग्रीनिर्धारणार्थं सुपरनेटेंटं त्रयोः भिन्नतरङ्गदैर्घ्ययोः अवशोषणस्य मापनं कृत्वा कलरमेट्रिकरूपेण एकत्रितम् (अ४७०, अ६४६ तथा अ६६३ एनएम)। अन्ते प्रकाशसंश्लेषणवर्णकानाम् सामग्रीयाः गणना Lichtenthaler (1987) इत्यनेन वर्णितानां निम्नलिखितसूत्राणां 4–6 इत्यस्य उपयोगेन कृता ।
72 घण्टे उपचारोत्तर (hpt) पर, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) तथा सुपरऑक्साइड आयन (O2•−) इत्येतयोः स्थानिकरूपेण ऊतकरासायनिकस्थानीकरणार्थं प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतितः पत्राणि (ऊर्ध्वतः द्वितीयं तृतीयं च पूर्णतया विकसितानि पत्राणि) एकत्रितानि आसन् प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतिं पञ्च घटाः (प्रतिघटं द्वौ वनस्पतौ) आसीत् । प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतिं द्वितीयकरूपेण (द्वौ तकनीकीप्रतिकृतौ) विश्लेषितं यत् पद्धतेः सटीकता, विश्वसनीयता, पुनरुत्पादनक्षमता च सुनिश्चिता भवति स्म Romero-Puertas et al. (2004) तथा एडम् एट अल. (1989) लघु परिवर्तन सहित। H2O2 इत्यस्य ऊतकरासायनिकस्थानीयीकरणार्थं 10 mM Tris बफर (pH 7.8) इत्यस्मिन् 0.1% DAB इत्यनेन सह वैक्यूम इन्फ्लिट् कृत्वा ततः प्रकाशे 60 मिन्ट् यावत् कक्षतापमाने इन्क्यूबेशनं कृतम् पत्रिकाः 0.15% (v/v) TCA इत्यस्मिन् 4:1 (v/v) इथेनॉल:क्लोरोफॉर्म (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) इत्यस्मिन् प्रक्षालिताः ततः प्रकाशस्य संपर्कं कृतवन्तः यावत् ते अन्धकारं न भवन्ति। तथैव वाल्वेषु O2•− इत्यस्य ऊतकरासायनिकस्थानीयीकरणार्थं 0.1 w/v % HBT युक्तेन 10 mM पोटेशियमफॉस्फेटबफरेन (pH 7.8) वैक्यूम-प्रवेशः कृतः पत्रिकाः २० मिन्ट् यावत् कक्षतापमाने प्रकाशे इन्क्यूबेशनं कृतवन्तः, ततः उपरिष्टाद् यथा प्रक्षालिताः, ततः यावत् कृष्णनील/बैंगनीवर्णीयबिन्दवः न दृश्यन्ते तावत् प्रकाशिताः परिणामी भूरेण (H2O2 सूचकरूपेण) अथवा नील-बैंगनी (O2•− सूचकरूपेण) वर्णस्य तीव्रता इमेज् प्रोसेसिंग संकुल ImageJ (http://fiji.sc; अभिगमन तिथि 7 मार्च 2024) इत्यस्य फिजी संस्करणस्य उपयोगेन मूल्याङ्किता
मलोन्डियाल्डीहाइड् (MDA; लिपिड पेरोक्साइडेशनस्य चिह्नरूपेण) डु तथा ब्रैमलेज (1992) इत्येतयोः पद्धत्या किञ्चित् परिवर्तनं कृत्वा निर्धारितम् । प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतितः (ऊर्ध्वतः द्वितीयं तृतीयं च पूर्णतया विकसितं पत्रं) ७२ घण्टानन्तरं उपचारानन्तरं (hpt) एकत्रितं कृतम् । प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतिं पञ्च घटाः (प्रतिघटं द्वौ वनस्पतौ) अन्तर्भवति स्म । प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतिं द्वितीयकरूपेण (द्वौ तकनीकीप्रतिकृतौ) विश्लेषितं यत् पद्धतेः सटीकता, विश्वसनीयता, पुनरुत्पादनक्षमता च सुनिश्चिता भवति स्म संक्षेपेण, 0.01% ब्यूटाइलेटेड् हाइड्रोक्सीटोलुइन (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) युक्ते 20% ट्राइक्लोरोएसिटिक अम्लेन (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) सह एमडीए निष्कर्षणार्थं 0.5 ग्रामस्य ग्राउण्ड् पर्णस्य ऊतकस्य उपयोगः कृतः ततः सुपरनेटेन्ट् इत्यस्मिन् MDA सामग्रीं UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् (Shimadzu Corporation, Japan) इत्यस्य उपयोगेन 532 तथा 600 nm इत्यत्र अवशोषणं माप्य वर्णमापीरूपेण निर्धारितं ततः nmol g−1 FW इति रूपेण व्यक्तं कृतम्
गैर-एन्जाइमिक-एन्जाइमिक-एण्टीऑक्सिडेण्ट्-मूल्यांकनार्थं, प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतितः ७२ घण्टानां पश्चात् उपचारात् (hpt) पत्राणि (ऊर्ध्वतः द्वितीयं तृतीयं च पूर्णतया विकसितानि पत्राणि) एकत्रितानि आसन् प्रत्येकं जैविकप्रतिकृतिं पञ्च घटाः (प्रतिघटं द्वौ वनस्पतौ) आसीत् । प्रत्येकं जैविकनमूना द्वितीयकरूपेण (द्वौ तकनीकीनमूनौ) विश्लेषणं कृतम् । द्रवनाइट्रोजनेन पत्रद्वयं पिष्ट्वा एन्जाइमिक-अ-एन्जाइमिक-एण्टीऑक्सिडेण्ट्, कुल-अमीनो-अम्ल-प्रोलिन-सामग्री, जीन-अभिव्यक्तिः, आक्सालेट्-मात्रा-निर्धारणाय च प्रत्यक्षतया उपयोगः कृतः
कुल घुलनशील फिनोलिक्स् Folin-Ciocalteu अभिकर्मक (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) इत्यस्य उपयोगेन काहकोनेन् इत्याख्येन वर्णितस्य पद्धतेः मामूली परिवर्तनेन सह निर्धारिताः आसन् (1999) इति । संक्षेपेण, प्रायः ०.१ ग्रामं समरूपपत्रस्य ऊतकं २० मिलीलीटर ८०% मेथनॉलेन सह अन्धकारे २४ घण्टापर्यन्तं निष्कास्य अपकेन्द्रीकरणानन्तरं सुपरनटैण्ट् एकत्रितम् नमूनासारस्य ०.१ मिलीलीटरं ०.५ मिलीलीटर फोलिन्-सियोकाल्टेउ अभिकर्मकेन (१०%) मिश्रयित्वा ३० s यावत् कम्पयित्वा ५ मिन्ट् यावत् अन्धकारे त्यक्तम् ततः प्रत्येकं नलिके २०% सोडियमकार्बोनेट् घोलस्य (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) ०.५ मिलीलीटरं योजयित्वा सम्यक् मिश्रितं कृत्वा कक्षतापमाने अन्धकारे १ घण्टापर्यन्तं इन्क्यूबेट् कृतम् ऊष्मायनानन्तरं प्रतिक्रियामिश्रणस्य अवशोषणक्षमता UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् (Shimadzu Corporation, Japan) इत्यस्य उपयोगेन 765 nm इत्यत्र मापिता । नमूना-अर्केषु कुल-घुलनशील-फिनोल-सान्द्रतां गैलिक-अम्ल-मापन-वक्रस्य (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) इत्यस्य उपयोगेन निर्धारिता, तथा च ताजा-भारस्य प्रति ग्राम-गैलिक-अम्ल-समतुल्यस्य मिलीग्राम-रूपेण व्यक्ता (mg GAE g-1 ताजा-भारः)
कुल घुलनशील फ्लेवोनोइड सामग्री Djeridane et al. (2006) इत्यनेन किञ्चित् परिवर्तनं कृतम् । संक्षेपेण, उपर्युक्तस्य मेथनॉल-सारस्य 0.3 मिलीलीटरं 0.3 मिलीलीटर-5% एल्युमिनियम-क्लोराइड-विलयनेन (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) सह मिश्रयित्वा, प्रबलतया हलचलं कृत्वा ततः कक्षतापमाने 5 मि औषधं चिकित्सासामग्री च, कैरो, मिस्र), सम्यक् मिश्रितं कृत्वा अन्धकारे ३० मिन्ट् यावत् कक्षतापमाने इन्क्यूबेट् कृतम्। ऊष्मायनानन्तरं प्रतिक्रियामिश्रणस्य अवशोषणक्षमता UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् (Shimadzu Corporation, Japan) इत्यस्य उपयोगेन 430 nm इत्यत्र मापिता । नमूना-अर्केषु कुल-घुलनशील-फ्लेवोनोइड्-सान्द्रता रुटिन-मापन-वक्रस्य (TCI America, Portland, OR, USA) इत्यस्य उपयोगेन निर्धारिता, ततः ताजा-भारस्य प्रति ग्रामस्य (mg RE g-1 ताजा-भारस्य) रुटिन-समतुल्यस्य मिलीग्राम-रूपेण व्यक्ता
बीनपत्रेषु कुलमुक्त अमीनो अम्लसामग्री योकोयामा तथा हिरामात्सु (2003) द्वारा प्रस्तावितायाः पद्धत्याः आधारेण संशोधितस्य निन्हाइड्रिन् अभिकर्मकस्य (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) इत्यस्य उपयोगेन निर्धारिता तथा च Sun et al. (2006) इति । संक्षेपेण, 0.1 ग्रामं ग्राउण्ड् ऊतकं pH 5.4 बफरेन निष्कासितम्, तथा च 200 μL सुपरनेटेंटं 200 μL निन्हाइड्रिन् (2%) तथा 200 μL पाइरिडिन् (10%; स्पेक्ट्रम केमिकल, न्यू ब्रन्सविक्, एनजे, अमेरिका) इत्यनेन सह प्रतिक्रियां कृत्वा, उष्णजलस्नाने 30 मिनिट् यावत् इन्क्यूबेट् कृत्वा, ततः शीतलं कृत्वा मापितं ५८० एनएम UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् (Shimadzu Corporation, Japan) इत्यस्य उपयोगेन । अपरपक्षे प्रोलिन् बेट्स् पद्धत्या निर्धारितम् (Bates et al., 1973) । प्रोलिनं 3% सल्फोसैलिसिलिक अम्लेन (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) निष्कर्षणं कृत्वा अपकेन्द्रीकरणानन्तरं 0.5 मिलीलीटरं सुपरनेटेंटं 1 मिलीलीटर हिमनदी एसिटिक अम्लेन (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) तथा निन्हाइड्रिन् अभिकर्मकेन सह मिश्रयित्वा 90°C मध्ये 45 मिन्ट् यावत् इन्क्यूबेट् कृत्वा शीतलं कृत्वा मापितं कृतम् उपरिष्टाद् समानं स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् उपयुज्य ५२० एनएम । पत्रस्य अर्केषु कुलमुक्त-अमीनो-अम्लानि प्रोलिन् च क्रमशः ग्लाइसिन-प्रोलिन-मापनवक्रयोः (सिग्मा-एल्ड्रिच्, सेण्ट् लुईस्, एमओ, अमेरिका) इत्यस्य उपयोगेन निर्धारिताः, तथा च mg/g ताजाभाररूपेण व्यक्ताः
एण्टीऑक्सिडेंट एन्जाइमस्य एंजाइमी गतिविधिं निर्धारयितुं 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) तथा 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, अमेरिका), शीतकरणस्य (4 °C) अन्तर्गतं 20 मिन्ट् यावत् 10,000 × g इत्यत्र अपकेन्द्रीकरणं कृतम्, तथा च सुपरनेटेंट (कच्चा एन्जाइम अर्क) एकत्रितं (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)। ततः कैटालेज (CAT) इत्यस्य 2 ml 0.1 M सोडियम फॉस्फेट बफर (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) तथा 100 μl 269 mM H2O2 घोल इत्यनेन सह प्रतिक्रिया कृत्वा एबी (1984) इत्यस्य पद्धत्या मामूली परिवर्तनेन (El-Nagar et al., 2023; उस्मान एट अल., 2023). Guaiacol-निर्भर पेरोक्साइडेज (POX) एंजाइमी गतिविधि Harrach et al. (2009) इति । (2008) लघुसंशोधनेन (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) तथा च 100 mM सोडियम फॉस्फेट बफर (pH 6.0) के 2.2 ml, गुआयकोल (TCI chemicals, Portland, OR, USA) तथा 100 μl 12 mM H2O2. विधिः (एल-नगरः इत्यादयः, २०२३; उस्मान् इत्यादयः, २०२३) इत्यस्मात् किञ्चित् परिवर्तितः आसीत् । 0.1 M फॉस्फेट बफर (pH 6.0) इत्यस्मिन् ताजातया निर्मितेन 3 मिलीलीटर कैटेकोल घोल (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) इत्यनेन सह प्रतिक्रियायाः अनन्तरं परीक्षणं कृतम् CAT गतिविधिः 240 nm (A240) इत्यत्र H2O2 इत्यस्य अपघटनस्य निरीक्षणेन मापिता, POX गतिविधिः 436 nm (A436) इत्यत्र अवशोषणस्य वृद्धेः निरीक्षणेन मापिता, तथा च UV-160A इत्यस्य उपयोगेन प्रत्येकं 30 s यावत् 3 min यावत् 495 nm (A495) इत्यत्र अवशोषणस्य उतार-चढावस्य अभिलेखनं कृत्वा PPO क्रियाकलापस्य मापनं कृतम् स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाजु, जापान)।
पेरोक्सिसोमल कैटालेज (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), सुपरऑक्साइड डिस्मुटेज (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), तथा ग्लूटाथियोन रिडक्टेज (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), बीनपत्रेषु (ऊर्ध्वतः द्वितीयं तृतीयं च पूर्णतया विकसितं पत्रं) अन्तिमचिकित्सायाः ७२ घण्टानन्तरं । संक्षेपेण, निर्मातुः प्रोटोकॉलस्य अनुसारं Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) इत्यस्य उपयोगेन आरएनए इत्यस्य पृथक्करणं कृतम् । ततः निर्मातुः निर्देशानुसारं TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit इत्यस्य उपयोगेन cDNA इत्यस्य संश्लेषणं कृतम् । उपर्युक्तत्रयजीनानां प्राइमर-अनुक्रमाः पूरकसारणी S3 मध्ये सूचीबद्धाः सन्ति । PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) इत्यस्य उपयोगः गृहपालनजीनस्य रूपेण कृतः तथा च सापेक्षिकजीनव्यञ्जनस्य गणना 2-ΔΔCT पद्धत्याः उपयोगेन कृता (Livak and Schmittgen, 2001) जैविकतनावस्य अधीनं एक्टिनस्थिरता (सामान्यफलानां तथा एन्थ्राक्नोजकवकस्य Colletotrichum lindemuthianum इत्यस्य मध्ये असंगतपरस्परक्रिया) तथा अजैविकतनावस्य (शुष्कता, लवणता, न्यूनतापमानस्य) प्रदर्शनं कृतम् (Borges et al., 2012)।
अस्माभिः प्रारम्भे प्रोटीन-प्रोटीन-ब्लास्ट-उपकरणस्य (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) इत्यस्य उपयोगेन एस. संक्षेपेण, अस्माभिः Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 amino acids) तथा Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number) इत्यस्मात् OAH इत्यस्य उपयोगः कृतः XP_056833920.1; BLASTp इति राष्ट्रियजैवप्रौद्योगिकीसूचनाकेन्द्रस्य (NCBI) वेबसाइट् http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ इत्यत्र GenBank इत्यस्मिन् अद्यतनतया उपलब्धस्य S. sclerotiorum जीनोमदत्तांशस्य विरुद्धं कृतम्
तदतिरिक्तं, S. sclerotiorum (SsOAH) इत्यस्मात् पूर्वानुमानितं OAH जीनं तथा A. fijiensis CBS 313.89 इत्यस्मात् AfOAH इत्यस्य विकासात्मकं विश्लेषणं वंशानुगतवृक्षं च MEGA11 (Tamura et al., 2021) तथा JTT matrix-based model (Jones et अल., १९९२). वंशानुगतवृक्षं S. sclerotiorum तः सर्वेषां पूर्वानुमानित OAH जीनानां (SsOAH) प्रोटीन अनुक्रमस्य बहुसंरेखणविश्लेषणेन सह संयोजितम् आसीत् तथा च Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, २००७) । तदतिरिक्तं, S. sclerotiorum तः SsOAH इत्यस्य सर्वोत्तममेलन अमीनो अम्ल अनुक्रमाः ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) इत्यस्य उपयोगेन प्रश्नानुक्रमैः (AfOAH तथा PlOAH) (Larkin et al., 2007) इत्यनेन सह संरेखिताः, संरेखणे संरक्षितक्षेत्राणां दृश्यीकरणं ESPript उपकरणस्य (संस्करणं 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) इति ग्रन्थः ।
अपि च, S. sclerotiorum SsOAH इत्यस्य पूर्वानुमानितकार्यात्मकप्रतिनिधिक्षेत्रं संरक्षितस्थलानि च InterPro उपकरणस्य (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021) इत्यस्य उपयोगेन विभिन्नपरिवारेषु अन्तरक्रियाशीलरूपेण वर्गीकृताः आसन्। अन्ततः, पूर्वानुमानित S. sclerotiorum SsOAH इत्यस्य त्रि-आयामी (3D) संरचना मॉडलिंग् प्रोटीन होमोलॉजी/एनालॉगी रिकग्निशन इञ्जिन (Phyre2 सर्वर संस्करण 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) इत्यस्य उपयोगेन कृतम्, उपयोगेन मान्यं च कृतम् SWISS-MODEL सर्वर (https://swissmodel.expasy.org/) (बियासिनी एट अल., 2014) इति । पूर्वानुमानितत्रि-आयामी संरचना (PDB प्रारूप) UCSF-Chimera संकुल (संस्करण 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004) इत्यस्य उपयोगेन अन्तरक्रियाशीलरूपेण दृश्यमानं कृतम्
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमस्य माइसेलियमस्य ऑक्सालोएसिटेट् एसिटाइलहाइड्रोलेजस्य (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) इत्यस्य प्रतिलेखनस्तरस्य निर्धारणाय मात्रात्मकं वास्तविकसमयप्रतिदीप्तिपीसीआर-प्रयोगः कृतः संक्षेपेण, एस. तदनन्तरं कोशिकानां अन्तिम-IC50 सान्द्रतायां (क्रमशः प्रायः 40 तथा 3.2 mg/L) L-ornithine तथा कवकनाशक Rizolex-T इत्यनेन उपचारः कृतः ततः समानपरिस्थितौ अपरं 24 घण्टां यावत् संवर्धितम्। ऊष्मायनानन्तरं संस्कृतिषु 2500 आरपीएम इत्यत्र 5 मिन्ट् यावत् अपकेन्द्रीकरणं कृत्वा जीनव्यञ्जनविश्लेषणार्थं सुपरनेटेंटं (कवकमाइसेलियमं) एकत्रितम्। तथैव संक्रमणस्य ०, २४, ४८, ७२, ९६, १२० घण्टेषु संक्रमणानन्तरं संक्रमितवनस्पतिभ्यः कवकस्य माइसेलियमस्य संग्रहः कृतः येषु संक्रमित ऊतकानाम् उपरि श्वेतसांचः, कपासयुक्तः माइसेलियमः च निर्मितः आसीत् कवकमाइसेलियमतः आरएनए निष्कासितम् ततः उपरि वर्णितरीत्या cDNA संश्लेषितम् । SsOAH कृते प्राइमर अनुक्रमाः पूरकसारणी S3 मध्ये सूचीबद्धाः सन्ति। SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) इत्यस्य उपयोगः गृहपालनजीनस्य रूपेण कृतः, तथा च 2-ΔΔCT पद्धतेः उपयोगेन सापेक्षिकजीनव्यञ्जनस्य गणना कृता (Livak and Schmittgen, 2001)
आलू डेक्स्ट्रोज शोरबा (PDB) तथा कवकरोगजनकं स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम युक्त वनस्पति नमूनेषु Xu and Zhang (2000) इत्येतयोः पद्धत्या मामूली परिवर्तनं कृत्वा ऑक्सालिक अम्लस्य निर्धारणं कृतम् संक्षेपेण, एस. ऊष्मायनानन्तरं कवकसंस्कृतेः प्रथमं Whatman #1 फ़िल्टर पेपरद्वारा छाननं कृत्वा अवशिष्टं माइसेलियमं दूरीकर्तुं 2500 rpm इत्यत्र 5 min यावत् अपकेन्द्रीकरणं कृतम्। आक्सालेट् इत्यस्य अधिकमात्रानिर्णयार्थं सुपरनेटेंटं संग्रह्य ४°C मध्ये संगृहीतम् । वनस्पतिनमूनानां निर्माणार्थं प्रायः ०.१ ग्रामं वनस्पति ऊतकखण्डान् आसुतजलेन (प्रत्येकवारं २ मिलिलीटर) त्रिवारं निष्कासितम् ततः नमूनानां 2500 आरपीएम-पर्यन्तं 5 मिन्ट् यावत् अपकेन्द्रीकरणं कृतम्, सुपरनेटेंटं व्हाटमैन् क्रमाङ्क-1-छिद्रकपत्रेण शुष्कं छानयित्वा अग्रे विश्लेषणार्थं एकत्रितम्।
ऑक्सालिक अम्लस्य परिमाणात्मकविश्लेषणार्थं प्रतिक्रियामिश्रणं काचस्य स्टॉपरयुक्ते ट्यूबे निम्नलिखितक्रमेण निर्मितम् आसीत् : 0.2 मिलीलीटर नमूना (अथवा पीडीबी कल्चर छानने वा ऑक्सालिक अम्लस्य मानकविलयनम्), 0.11 मिलीलीटर ब्रोमोफेनोल् ब्लू (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml 1 M सल्फ्यूरिक अम्लम् (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) तथा 0.176 ml 100 mM पोटेशियम डाइक्रोमेट् (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA) च, ततः घोलं आसुतजलेन 4.8 ml यावत् पतला कृत्वा, प्रबलतया मिश्रयित्वा तत्क्षणमेव 60 °C जलमध्ये स्थापितं स्नानं। १० मि. प्रतिक्रियामिश्रणस्य अवशोषणक्षमता (A600) UV-160 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् (Shimadzu Corporation, Japan) इत्यस्य उपयोगेन 600 nm इत्यत्र मापिता । क्रमशः संस्कृति-छननानां, वनस्पति-नमूनानां च परिमाणनिर्धारणाय पीडीबी, आसुतजलं च नियन्त्रणरूपेण उपयुज्यते स्म । संस्कृति छानने आक्सालिक अम्लस्य सान्द्रता, पीडीबी माध्यमस्य प्रति मिलीलीटर (μg.mL−1) आक्सालिक अम्लस्य माइक्रोग्रामरूपेण व्यक्ता, तथा च पत्रस्य अर्कस्य, ताजा भारस्य प्रति ग्राम आक्सालिक अम्लस्य माइक्रोग्रामरूपेण व्यक्ता (μg.g−1 FW), ऑक्सालिक अम्लस्य मापनवक्रस्य (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, अमेरिका)।
सम्पूर्णे अध्ययने सर्वेषां प्रयोगानां परिकल्पना पूर्णतया यादृच्छिकरूपेण (CRD) कृता यत्र प्रति उपचारं षट् जैविकप्रतिकृतयः, प्रतिजैविकप्रतिकृतिः पञ्च घटाः (प्रतिघटं द्वौ वनस्पतौ) च यद्यपि अन्यथा न उक्तम्। जैविकप्रतिकृतीनां द्वितीयकरूपेण (द्वौ तकनीकीप्रतिकृतौ) विश्लेषणं कृतम् । तस्यैव प्रयोगस्य पुनरुत्पादनक्षमतायाः जाँचार्थं तकनीकीप्रतिकृतीनां उपयोगः कृतः परन्तु असत्यप्रतिकृतीनां परिहाराय सांख्यिकीयविश्लेषणे तेषां उपयोगः न कृतः आँकडानां सांख्यिकीयरूपेण विचरणविश्लेषणस्य (ANOVA) उपयोगेन विश्लेषणं कृतम् तदनन्तरं Tukey-Kramer ईमानदारीपूर्वकं महत्त्वपूर्णं अन्तरं (HSD) परीक्षणं (p ≤ 0.05) कृतम्। इन् विट्रो प्रयोगानां कृते प्रोबिट् मॉडल् इत्यस्य उपयोगेन IC50 तथा IC99 मूल्यानां गणना कृता तथा च 95% विश्वासान्तराणां गणना कृता ।
मिस्रदेशस्य एल-घबिया-राज्यस्य विभिन्नेभ्यः सोयाबीनक्षेत्रेभ्यः कुलचत्वारि पृथक्कृतानि एकत्रितानि । पीडीए माध्यमे सर्वेषु पृथक्कृतेषु मलाईयुक्तं श्वेतम् माइसेलियमं निर्मितम् यत् शीघ्रमेव कपासवत् श्वेतम् (चित्रम् १ ए) ततः स्क्लेरोटियम-पदे बेज-वर्णीयं वा भूरेण वा भवति स्म स्क्लेरोटिया प्रायः सघनः, कृष्णः, गोलाकारः अथवा अनियमितः आकारः, ५.२ तः ७.७ मि.मी.दीर्घः, ३.४ तः ५.३ मि.मी.व्यासः च भवति (चित्रम् १ ख) । यद्यपि चतुर्णां पृथक्करणानाम् 25 ± 2 °C (चित्र 1A) इत्यत्र 10–12 दिवसानां ऊष्मायनस्य अनन्तरं संस्कृतिमाध्यमस्य धारायाम् स्क्लेरोटियायाः सीमान्तप्रतिमानं विकसितम्, तथापि तेषु प्रतिप्लेटं स्क्लेरोटिया-सङ्ख्या महत्त्वपूर्णतया भिन्ना आसीत् (P < 0.001), यत्र पृथक्कृतेषु 3 मध्ये स्क्लेरोटिया-सङ्ख्या सर्वाधिका (32.33 ± 1.53 स्क्लेरोटिया प्रति) आसीत् प्लेट् ; तथैव, आइसोलेट् #3 इत्यनेन अन्येषां आइसोलेटानां (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; चित्रे 1D) अपेक्षया PDB इत्यस्मिन् अधिकं ऑक्सालिक-अम्लस्य उत्पादनं कृतम् । आइसोलेट् #3 इत्यनेन पादपरोगजनककवकस्य Sclerotinia sclerotiorum इत्यस्य विशिष्टानि रूपात्मकानि सूक्ष्मदर्शनानि च दर्शितानि । उदाहरणार्थं, पीडीए इत्यत्र, आइसोलेट् #3 इत्यस्य उपनिवेशाः तीव्रगत्या वर्धन्ते स्म, मलाईयुक्ताः श्वेताः (चित्रम् १ ए), विपरीतबेजवर्णाः अथवा हल्काः सामन् पीत-भूराः आसन्, ९ से.मी.व्यासस्य प्लेट् इत्यस्य पृष्ठभागं पूर्णतया आच्छादयितुं २५ ± २°C इत्यत्र ६-७ दिवसानां आवश्यकता भवति स्म उपर्युक्तरूपात्मकसूक्ष्मलक्षणानाम् आधारेण आइसोलेट् #3 इत्यस्य पहिचानः स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम इति कृतम् ।
चित्र 1. सामान्यफलसस्यानां पृथक्कृतानां एस.स्क्लेरोटिओरमस्य विशेषताः रोगजनकता च। (A) पीडीए माध्यमे चतुर्णां एस cultivar Giza 3 ग्रीनहाउस परिस्थितौ । मूल्यानि पञ्च जैविकप्रतिकृतीनां (n = 5) औसतं ± SD प्रतिनिधित्वं कुर्वन्ति । विभिन्नानि अक्षराणि उपचारानां मध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्णं भेदं सूचयन्ति (p < 0.05)। (F–H) क्रमशः भूमितः उपरि काण्डेषु सिलिकेषु च विशिष्टाः श्वेतसफूपस्य लक्षणाः, आइसोलेट् #3 (dpi) इत्यनेन टीकाकरणस्य 10 दिवसेभ्यः अनन्तरं दृश्यन्ते स्म (I) S. sclerotiorum आइसोलेट #3 इत्यस्य आन्तरिकप्रतिलेखितस्पेसर (ITS) क्षेत्रस्य विकासात्मकविश्लेषणं अधिकतमसंभावनापद्धतेः उपयोगेन कृतम् आसीत् तथा च राष्ट्रियजैवप्रौद्योगिकीसूचनाकेन्द्रात् (NCBI) आँकडाकोषात् (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) प्राप्तैः 20 सन्दर्भपृथक्कृतैः/उपभेदैः सह तुलना कृता समूहरेखायाः उपरि सङ्ख्याः प्रदेशव्याप्तिम् (%) सूचयन्ति, समूहरेखायाः अधः स्थापिताः सङ्ख्याः शाखादीर्घतां सूचयन्ति ।
अपि च, रोगजनकतायाः पुष्ट्यर्थं ग्रीनहाउस-स्थितौ संवेदनशील-व्यापारिक-बीन-जातेः Giza 3-इत्यस्य टीकाकरणार्थं चतुर्णां प्राप्तानां S. sclerotiorum-पृथक्करणानाम् उपयोगः कृतः, यत् कोचस्य धारणाभिः सह सङ्गतम् अस्ति (चित्रम् 1E) यद्यपि प्राप्ताः सर्वे कवक-पृथक्करणाः रोगजनकाः आसन् तथा च हरितबीजं (cv. Giza 3) संक्रमितुं शक्नुवन्ति स्म, येन टीकाकरणस्य १० दिवसेषु (dpi) भूमितः उपरि सर्वेषु भागेषु (चित्रम् १F), विशेषतः काण्डेषु (चित्रम् १G) फलेषु (चित्रम् १H) च विशिष्टानि श्वेत-फैल-लक्षणाः भवन्ति स्म, तथापि पृथक्करणं ३ स्वतन्त्रप्रयोगद्वयेषु सर्वाधिकं आक्रामकं पृथक्करणं आसीत् आइसोलेट् ३ इत्यस्य बीनवृक्षेषु सर्वाधिकं रोगस्य तीव्रता (%) आसीत् (संक्रमणस्य ७, १४, २१ दिवसेषु क्रमशः २४.० ± ४.०, ५८.० ± २.०, ७६.७ ± ३.१ च; चित्रम् १F)।
अत्यन्तं आक्रामकस्य एस. आइसोलेट #3 तथा 20 सन्दर्भ आइसोलेट/उपभेदानाम् मध्ये वंशानुगतविश्लेषणेन तयोः मध्ये उच्चसादृश्यं (>99%) दर्शितम्। ज्ञातव्यं यत् एस.स्क्लेरोटियोरम-आइसोलेट् #3 (533 bp) इत्यस्य शुष्क-मटर-बीजेभ्यः पृथक्कृतस्य अमेरिकन-एस OR206374.1; एनसीबीआई-दत्तांशकोशे नूतनः अनुक्रमः निक्षिप्तः अस्ति तथा च “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792) इति नामकरणं कृतम् अस्ति । द्रष्टुं शक्यते यत् आइसोलेट् ३ सर्वाधिकं आक्रामकः आइसोलेट् अस्ति; अतः अनन्तरं सर्वेषु प्रयोगेषु अध्ययनार्थं एतत् पृथक्करणं चयनितम् ।
एस. उल्लेखनीयं यत् एल-ओर्निथिन् जीवाणुनाशकप्रभावं कृतवान् तथा च क्रमेण एस. परीक्षिते सर्वोच्चसान्द्रतायां (१२५ मिग्रा/लीटर) एल-ओर्निथिन् सर्वाधिकमाइसेलियमवृद्धिनिरोधदरं (९९.६२ ± ०.२७%; चित्रं २ बी) प्रदर्शितवती, यत् परीक्षिते सर्वोच्चसान्द्रतायां (१० मिग्रा/लीटर) व्यावसायिककवकनाशकस्य रिजोलेक्स-टी (निरोधदरेण ९९.४५ ± ०.३९%; चित्रं २सी) इत्यस्य बराबरम् आसीत्, यत् समानं सूचयति प्रभावकारिता ।
चित्र 2. स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमविरुद्धं एल-ओर्निथिनस्य इन् विट्रो जीवाणुनाशकक्रियाकलापः। (A) S. sclerotiorum विरुद्धं L-ornithine इत्यस्य विभिन्नसान्द्रतायाः जीवाणुनाशकक्रियाकलापस्य तुलना व्यावसायिककवकनाशकेन Rizolex-T (10 mg/L) इत्यनेन सह। (B, C) क्रमशः L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 and 125 mg/L) अथवा Rizolex-T (2, 4, 6, 8 तथा 10 mg/L) इत्यस्य विभिन्नसान्द्रतायाः उपचारस्य अनन्तरं S. sclerotiorum mycelial वृद्धेः निरोधस्य दरः (%)। मूल्यानि पञ्च जैविकप्रतिकृतीनां (n = 5) औसतं ± SD प्रतिनिधित्वं कुर्वन्ति । भिन्नानि अक्षराणि उपचारानां मध्ये सांख्यिकीयभेदं सूचयन्ति (p < 0.05) । (D, E) क्रमशः एल-ओर्निथिन तथा व्यावसायिक कवकनाशक रिजोलेक्स-टी के प्रोबिट मॉडल प्रतिगमन विश्लेषण। प्रोबिट् मॉडल् प्रतिगमनरेखा ठोसनीलरेखारूपेण दर्शिता, विश्वासान्तरं (९५%) च विच्छिन्नलालरेखारूपेण दर्शिता ।
तदतिरिक्तं प्रोबिट् रिग्रेशन विश्लेषणं कृतम् अस्ति तथा च तत्सम्बद्धाः प्लॉट् सारणी 1 तथा चित्रेषु 2D,E दर्शिताः सन्ति। संक्षेपेण, एल-ओर्निथिनस्य स्वीकार्यप्रवणमूल्यं (y = 2.92x − 4.67) तथा तत्सम्बद्धाः महत्त्वपूर्णाः आँकडा: (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 तथा p < 0.0001; चित्रं 2D) व्यावसायिककवकनाशकस्य तुलने S. sclerotiorum विरुद्धं वर्धितां कवकविरोधी गतिविधिं सूचितवन्तः रिजोलेक्स-टी (y = 1.96x − 0.99, कॉक्स एण्ड स्नेल आर 2 = 0.1242, नागेलकेर्के आर 2 = 0.1708 तथा पी < 0.0001) (सारणी 1)।
तालिका 1. एस.
समग्रतया, एल-ओर्निथिन (250 मिग्रा/लीटर) इत्यनेन अनुपचारित-एस. संक्षेपेण, यद्यपि अनुपचारितसंक्रमितनियन्त्रणवनस्पतयः रोगस्य तीव्रता क्रमेण वर्धिता (५२.६७ ± १.५३, ८३.२१ ± २.६१, तथा ९२.३३ ± ३.०६%), तथापि एल-ओर्निथिन् इत्यनेन सम्पूर्णे प्रयोगे (८.९७ ± ०.१५, १८.०० ±) रोगस्य तीव्रता (%) महत्त्वपूर्णतया न्यूनीकृता १.००, तथा २६.३६ ± ३.०७) क्रमशः ७, १४, २१ दिवसेषु उपचारोत्तर (dpt) (चित्रम् ३ क) । तथैव यदा एस.स्क्लेरोटिओरम-संक्रमित-बीन-वनस्पतयः २५० मिग्रा/लीटर-एल-ओर्निथिनेन उपचारं कृतवन्तः तदा अचिकित्सिते नियन्त्रणे रोगप्रगतिवक्रस्य (AUDPC) अन्तर्गतं क्षेत्रफलं २८१.३३ ± ३३.१३ तः २८१.०३ ± ७.९५ यावत् न्यूनीकृतम्, यत् सकारात्मकनियन्त्रणस्य ५० मिग्रा/लीटरस्य अपेक्षया किञ्चित् न्यूनम् आसीत् रिजोलेक्स-टी कवकनाशक (183.61 ± 7.71; चित्र 3 बी)। द्वितीयप्रयोगे अपि एतादृशी एव प्रवृत्तिः अवलोकिता ।
चित्र 3. ग्रीनहाउस परिस्थितौ स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम इत्यनेन उत्पद्यमानस्य सामान्यबीजस्य श्वेतसड़नस्य विकासे एल-ओर्निथिनस्य बहिर्जातप्रयोगस्य प्रभावः। (A) 250 mg/L L-ornithine इत्यनेन उपचारानन्तरं सामान्यबीजस्य श्वेतस्य सांचस्य रोगप्रगतिः वक्रः। (B) एल-ओर्निथिन इत्यनेन उपचारानन्तरं सामान्यबीजस्य श्वेतसफस्य रोगप्रगतिवक्रस्य (AUDPC) अधः क्षेत्रम्। मूल्यानि पञ्च जैविकप्रतिकृतीनां (n = 5) औसतं ± SD प्रतिनिधित्वं कुर्वन्ति । विभिन्नानि अक्षराणि उपचारानां मध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्णं भेदं सूचयन्ति (p < 0.05)।
२५० मिग्रा/लीटर एल-ओर्निथिनस्य बहिर्जातप्रयोगेन ४२ दिवसानां अनन्तरं क्रमेण वनस्पतिस्य ऊर्ध्वता (चित्रम् ४ क), प्रतिपादपशाखानां संख्या (चित्रम् ४ ख), प्रतिपादपस्य पत्रसङ्ख्या (चित्रम् ४ ग) च वर्धिता यद्यपि व्यावसायिककवकनाशकस्य Rizolex-T (50 mg/L) अध्ययनं कृतेषु सर्वेषु पोषणमापदण्डेषु सर्वाधिकं प्रभावं कृतवान्, तथापि 250 mg/L L-ornithine इत्यस्य बहिर्जातप्रयोगस्य अउपचारितनियन्त्रणानां तुलने द्वितीयः सर्वाधिकं प्रभावः अभवत् (चित्र 4A–C)। अपरपक्षे, एल-ओर्निथिन-उपचारस्य प्रकाशसंश्लेषण-रञ्जक-क्लोरोफिल-ए (चित्रम् 4D) तथा क्लोरोफिल-बी (चित्र-4E) इत्येतयोः सामग्रीयां कोऽपि महत्त्वपूर्णः प्रभावः नासीत्, परन्तु नकारात्मक-नियन्त्रणस्य (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) तथा च सकारात्मक नियन्त्रण (0.46 ± 0.02 mg / g fr wt; चित्र 4F)। समग्रतया एते परिणामाः सूचयन्ति यत् एल-ओर्निथिन् उपचारितफलानां कृते पादपविषाक्तं नास्ति तथा च तेषां वृद्धिं उत्तेजितुं अपि शक्नोति ।
चित्र 4. ग्रीनहाउस परिस्थितिषु स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम इत्यनेन संक्रमितबीजपत्रेषु वृद्धिविशेषतासु प्रकाशसंश्लेषणरञ्जकेषु च बहिर्जातीयएल-ओर्निथिनप्रयोगस्य प्रभावः। (A) पौधे की ऊंचाई (cm), (B) प्रति पौधे शाखाओं की संख्या, (C) प्रति पौधे पत्रों की संख्या, (D) क्लोरोफिल a सामग्री (mg g-1 fr wt), (E) क्लोरोफिल ख सामग्री (mg g-1 fr wt), (F) कुल कैरोटीनोइड सामग्री (mg g-1 fr wt)। मूल्यानि पञ्च जैविकप्रतिकृतीनां (n = 5) औसतं ± SD भवन्ति । विभिन्नानि अक्षराणि उपचारानां मध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्णं भेदं सूचयन्ति (p < 0.05)।
प्रतिक्रियाशील-आक्सीजन-प्रजातीनां (ROS; हाइड्रोजन-पेरोक्साइड् [H2O2] इति रूपेण व्यक्तः) तथा मुक्त-कणानां (सुपर-आक्साइड-आयन-रूपेण अभिव्यक्तः [O2•−]) स्थाने एव ऊतक-रासायनिक-स्थानीयीकरणेन ज्ञातं यत् L-ornithine (250 mg/L) इत्यस्य बहिर्जातीय-प्रयोगेन H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW) इत्यस्य संचयः महत्त्वपूर्णतया न्यूनीकृतः चित्र 5A) तथा O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; चित्र 5B) इत्येतयोः तुलने अनुपचारितसंक्रमितपौधयोः (क्रमशः 173.31 ± 12.06 तथा 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) तथा 50 mg/L व्यावसायिककवकनाशकेन उपचारितवनस्पतयोः संचयः रिजोलेक्स-टी (क्रमशः १७०.१२ ± ९.५० तथा १५७.०० ± ७.८१ nmol.g−१ fr wt) ७२ घ. hpt इत्यस्य अन्तर्गतं H2O2 तथा O2•− इत्यस्य उच्चस्तरः संचितः (चित्रम् 5A, B) । तथैव TCA-आधारितं malondialdehyde (MDA) परीक्षणेन ज्ञातं यत् S. sclerotiorum-संक्रमितबीन-वनस्पतयः स्व-पत्रेषु MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) अधिकस्तरं संचितवन्तः (चित्र 5C) परन्तु एल-ओर्निथिनस्य बहिर्जातप्रयोगेन लिपिड् पेरोक्साइडेशनं महत्त्वपूर्णतया न्यूनीकृतम् यस्य प्रमाणं उपचारितपौधेषु एमडीए सामग्रीयां न्यूनता (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) अस्ति
चित्र 5. ग्रीनहाउस परिस्थितिषु संक्रमणस्य 72 घण्टानन्तरं एस. (A) हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt पर, (B) सुपरऑक्साइड आयन (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt पर, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt पर, (D) कुल घुलनशील फिनोल (mg GAE g−1 FW) 72 hpt, (E) 72 hpt पर कुल घुलनशील फ्लेवोनोइड्स (mg RE g−1 FW), (F) 72 hpt पर कुल मुक्त अमीनो अम्ल (mg g−1 FW), तथा (G) 72 hpt पर प्रोलाइन सामग्री (mg g−1 FW)। मूल्यानि 5 जैविकप्रतिकृतीनां (n = 5) औसतं ± मानकविचलनं (मध्यम ± SD) प्रतिनिधित्वं कुर्वन्ति । विभिन्नानि अक्षराणि उपचारानां मध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्णं भेदं सूचयन्ति (p < 0.05)।