वर्तमान *वर्तमान पता: कोलोन 50931, जर्मनी, कोलोन उत्कृष्टता समूह अनुसंधान on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
माइटोकॉन्ड्रियारोगाणां न्यूरोडीजनरेशनं अपरिवर्तनीयं मन्यते यतोहि न्यूरॉन्सस्य चयापचयप्लास्टिसिटी सीमितं भवति, परन्तु शरीरे न्यूरॉन्सीचयापचयस्य कोशिकास्वायत्ततायां माइटोकॉन्ड्रियाविकारस्य प्रभावः दुर्बोधः अस्ति अत्र, वयं बाधित-माइटोकॉन्ड्रिया-संलयन-गतिशीलतायाः कारणेन प्रगतिशील-OXPHOS-अभावेन सह पुर्किन्जे-न्यूरोन-कोशिका-विशिष्ट-प्रोटीओमस्य परिचयं कुर्मः । अस्माभिः ज्ञातं यत् माइटोकॉन्ड्रिया-विकारेन प्रोटीओमिक्स-क्षेत्रे गहनं परिवर्तनं प्रेरितम्, अन्ततः कोशिकामृत्युपूर्वं सटीकचयापचयकार्यक्रमानाम् क्रमिकसक्रियीकरणं भवति अप्रत्याशितरूपेण, वयं TCA चक्रमध्यस्थानां पूरकत्वेन सम्बद्धानां पाइरुवेट् कार्बोक्जिलेजस्य (PCx) अन्येषां पेरोक्साइडेजानां च स्पष्टप्रेरणं निर्धारितवन्तः। PCx इत्यस्य निरोधेन आक्सीडेटिव तनावः न्यूरोडीजनरेशनं च अधिकं जातम्, यत् सूचयति यत् OXPHOS इत्यस्य अभावयुक्तेषु न्यूरॉन्सेषु धमनीकाठिन्यस्य सुरक्षात्मकः प्रभावः भवति । अन्तिमरूपेण क्षीण-न्यूरोन्-मध्ये माइटोकॉन्ड्रिया-संलयनस्य पुनर्स्थापनेन एतानि चयापचय-लक्षणं पूर्णतया विपर्यस्तं भवति, येन कोशिका-मृत्युः निवारितः भवति अस्माकं निष्कर्षाः पूर्वं अज्ञातमार्गान् चिनोति ये माइटोकॉन्ड्रियाविकारस्य प्रतिरोधकशक्तिं ददति तथा च दर्शयन्ति यत् रोगस्य उत्तरपदेषु अपि न्यूरोडिजनरेशनं विपर्यस्तं कर्तुं शक्यते।
न्यूरॉनल ऊर्जा चयापचयस्य निर्वाहने माइटोकॉन्ड्रियायाः केन्द्रीयभूमिका मानवमाइटोकॉन्ड्रियारोगैः सह सम्बद्धैः विस्तृतैः न्यूरोलॉजिकललक्षणैः बलं दत्तं भवति एतेषु अधिकांशः रोगाः जीन-उत्परिवर्तनस्य कारणेन भवन्ति ये माइटोकॉन्ड्रिया-जीन-अभिव्यक्तिं (1, 2) अथवा माइटोकॉन्ड्रिया-गतिविज्ञानेन सह सम्बद्धं जीन-विनाशं नियन्त्रयन्ति, ये माइटोकॉन्ड्रिया-डीएनए (mtDNA) (3, 4) इत्यस्य स्थिरतां परोक्षरूपेण प्रभावितयन्ति पशुमाडलयोः कार्येण ज्ञातं यत् परितः ऊतकयोः माइटोकॉन्ड्रियाविकारस्य प्रतिक्रियारूपेण रूढिवादी चयापचयमार्गाः (५-७) सक्रियः कर्तुं शक्यन्ते, अतः एतेषां जटिलरोगाणां रोगजननस्य महत्त्वपूर्णा अन्वेषणं प्राप्यते तस्य विपरीतम्, मस्तिष्कस्य माइटोकॉन्ड्रिया एडेनोसाइन् ट्राइफॉस्फेट (ATP) उत्पादनस्य सामान्यविफलतायाः कारणेन विशिष्टकोशिकाप्रकारस्य चयापचयपरिवर्तनस्य विषये अस्माकं अवगमनं मौलिकं भवति (8), यत् चिकित्सालक्ष्याणां पहिचानस्य आवश्यकतायां बलं ददाति, येषां उपयोगः रोगस्य निवारणाय वा निवारणाय वा कर्तुं शक्यते। न्यूरोडिजनरेशन (9) निवारयन्तु। सूचनायाः अभावः अस्ति यत् तंत्रिकाकोशिकानां व्यापकरूपेण परितः ऊतकानाम् कोशिकाप्रकारानाम् अपेक्षया अत्यन्तं सीमितचयापचयलचीलता इति मन्यते (१०) एतत् दृष्ट्वा यत् एताः कोशिका: सिनैप्टिक-संचरणं प्रवर्धयितुं तथा च चोट-रोग-स्थितौ प्रतिक्रियां दातुं न्यूरॉन्-भ्यः चयापचयद्रव्याणां आपूर्तिं समन्वययितुं केन्द्रीयभूमिकां निर्वहन्ति, मस्तिष्क-उपस्थानां चुनौतीपूर्ण-स्थितौ कोशिका-चयापचयस्य अनुकूलनस्य क्षमता प्रायः ग्लिया-कोशिकासु सीमितं भवति (११-१४) तदतिरिक्तं मस्तिष्कस्य ऊतकस्य निहितकोशिकीयविषमता विशिष्टेषु न्यूरॉनल उपसमूहेषु भवन्ति चयापचयपरिवर्तनानां अध्ययनं बहुधा बाधते फलतः न्यूरॉन्-मध्ये माइटोकॉन्ड्रिया-विकारस्य सटीक-कोशिकीय-चयापचय-परिणामानां विषये अल्पं ज्ञायते ।
माइटोकॉन्ड्रिया-विकारस्य चयापचय-परिणामान् अवगन्तुं वयं माइटोकॉन्ड्रिया-बाह्य-झिल्ली-संलयनस्य (Mfn2) विनाशस्य कारणेन न्यूरो-क्षयस्य विभिन्न-चरणयोः पुर्किन्जे-न्यूरोन्स् (PNs) पृथक् कृतवन्तः यद्यपि मनुष्येषु Mfn2 उत्परिवर्तनं वंशानुगतमोटरसंवेदी न्यूरोपैथी इत्यस्य एकेन प्रकारेण सह सम्बद्धं भवति यत् Charcot-Marie-Tooth type 2A (15) इति नाम्ना प्रसिद्धम् अस्ति, तथापि मूषकेषु Mfn2 इत्यस्य सशर्तविनाशः ऑक्सीकरणस्य सुप्रसिद्धः प्रेरणः Phosphorylation (OXPHOS) विकारविधिः अस्ति विभिन्नाः न्यूरॉनल उपप्रकाराः (16-19) तथा च परिणामी न्यूरोडिजनरेटिव फेनोटाइपः प्रगतिशीलन्यूरोलॉजिकल लक्षणैः सह भवति, यथा गतिविकारः (18, 19) अथवा सेरिबेलर अटैक्सिया (16) लेबल-मुक्त मात्रात्मक (LFQ) प्रोटीओमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, इमेजिंग, तथा वायरलॉजिकल पद्धतीनां संयोजनस्य उपयोगेन वयं दर्शयामः यत् प्रगतिशीलं न्यूरोडिजनरेशनं दृढतया पाइरुवेट् कार्बोक्जिलेज (PCx) तथा च अन्यकारकान् प्रेरयति ये PNs इत्यस्य धमनीकाठिन्येन सम्बद्धाः सन्ति in vivo एन्जाइमस्य अभिव्यक्तिः। अस्य निष्कर्षस्य प्रासंगिकतां सत्यापयितुं वयं विशेषतया Mfn2-अभावयुक्तेषु PNs मध्ये PCx इत्यस्य अभिव्यक्तिं डाउन-रेगुलेटं कृतवन्तः, तथा च ज्ञातवन्तः यत् एतत् शल्यक्रिया आक्सीडेटिव तनावं वर्धयति तथा च न्यूरोडिजनरेशनं त्वरितवान्, अतः सिद्धं जातं यत् एजोस्पर्मिया कोशिकामृत्युं चयापचयीय अनुकूलतां प्रदाति। MFN2 इत्यस्य गम्भीरव्यञ्जना गम्भीर OXPHOS-अभावेन, माइटोकॉन्ड्रिया-डीएनए-इत्यस्य विशाल-सेवनेन, तथा च प्रत्यक्षतया भग्न-माइटोकॉन्ड्रिया-जालेन सह अन्तिम-क्षय-PN-इत्यस्य पूर्णतया उद्धारं कर्तुं शक्नोति, यत् अधिकं बोधयति यत् न्यूरो-क्षयस्य एतत् रूपं कोशिका-मृत्युपूर्वं रोगस्य उन्नत-पदे अपि पुनः प्राप्तुं शक्नोति
Mfn2 नॉकआउट PNs मध्ये माइटोकॉन्ड्रियायाः दृश्यीकरणार्थं, अस्माभिः एकस्य मूषकस्य तनावस्य उपयोगः कृतः यत् Cre-निर्भरं माइटोकॉन्ड्रियाः पीतप्रतिदीप्तप्रोटीन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्तिं लक्ष्यं कर्तुं अनुमतिं ददाति तथा च माइटोकॉन्ड्रिया आकृतिविज्ञानस्य जाँचं विवो इत्यत्र कृतवन्तः। अस्माभिः ज्ञातं यत् PNs मध्ये Mfn2 जीनस्य विनाशेन माइटोकॉन्ड्रियाजालस्य क्रमिकविभाजनं भविष्यति (चित्रम् S1A), तथा च 3 सप्ताहे आयुषः प्रारम्भिकः परिवर्तनः प्राप्तः तस्य विपरीतम्, पीएन कोशिकास्तरस्य पर्याप्तं क्षयः, यस्य प्रमाणं Calbindin immunostaining इत्यस्य हानिः भवति, 12 सप्ताहस्य आयुः यावत् न आरब्धम् (चित्रम् 1, A, B) माइटोकॉन्ड्रियारूपविज्ञानस्य प्रारम्भिकपरिवर्तनानां न्यूरॉनलमृत्युस्य दृश्यमानस्य आरम्भस्य च समयस्य असङ्गतिः अस्मान् कोशिकामृत्युपूर्वं माइटोकॉन्ड्रियाविकारेण प्रेरितस्य चयापचयपरिवर्तनस्य अन्वेषणं कर्तुं प्रेरितवान् अस्माभिः YFP (YFP +)-अभिव्यक्तं पीएन (चित्रम् 1C) पृथक् कर्तुं प्रतिदीप्ति-सक्रिय-सक्रिय-कोशिका-छाँटीकरण (FACS)-आधारित-रणनीतिः विकसिता, तथा च नियन्त्रण-मूषकेषु (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), अतः परं CTRL (चित्रम् S1B) इति उच्यते। YFP संकेतस्य सापेक्षिकतीव्रतायां आधारितं गेटिंग् रणनीत्याः अनुकूलनं अस्मान् गैर-PNs (YFPneg) (चित्र S1B) अथवा कथितप्रतिदीप्त अक्षतंतु/डेण्ड्रिटिक-खण्डेभ्यः (YFPlow; चित्रा S1D, बाम) तः PNs इत्यस्य YFP + शरीरं (YFPhigh) शुद्धं कर्तुं शक्नोति, यस्य पुष्टिः confocal microscope (चित्र S1D, दक्षिणतः) कृता अस्ति। वर्गीकृतजनसंख्यायाः पहिचानस्य सत्यापनार्थं वयं LFQ प्रोटीओमिक्सं ततः मुख्यघटकविश्लेषणं च कृतवन्तः, तथा च ज्ञातवन्तः यत् YFPhigh तथा YFPneg कोशिकानां मध्ये स्पष्टपृथक्करणं भवति (चित्रं S1C)। YFPhigh कोशिका ज्ञात PNs मार्कर (अर्थात Calb1, Pcp2, Grid2 तथा Itpr3) (21, 22) (21, 22) (21, 22) (21, 22) (21, 22) (21, 22) (21, 22) (21, 22) (21, 22) इति चिह्नानां शुद्धसंवर्धनं दर्शितवान्, परन्तु न्यूरॉन्स अथवा अन्यकोशिकाप्रकारेषु सामान्यतया अभिव्यक्तस्य प्रोटीनस्य समृद्धिः नासीत् (चित्रम् 1D) स्वतन्त्रप्रयोगेषु एकत्रितवर्गीकृत YFPhigh कोशिकासु नमूनानां मध्ये तुलनायां सहसंबन्धगुणकं> 0.9 दर्शितम्, जैविकप्रतिकृतीनां मध्ये उत्तमं पुनरुत्पादनक्षमतां प्रदर्शयति (चित्रं S1E)। सारांशेन, एते आँकडा: व्यवहार्य पीएन इत्यस्य तीव्रविशिष्टपृथक्करणस्य अस्माकं योजनां प्रमाणीकृतवन्तः। यतो हि प्रयुक्ता L7-cre चालकप्रणाली प्रसवस्य (23) अनन्तरं प्रथमसप्ताहे मोज़ेकपुनर्संयोजनं प्रेरयति, अतः वयं CTRL तः मूषकान् कलिंगं कर्तुं आरब्धाः तथा च सशर्तं (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) न्यूरॉन्सं संग्रहयन्ति। पुनर्संयोजनस्य समाप्तेः अनन्तरं ४ सप्ताहे Mfn2cKO इति कथ्यते । अन्त्यबिन्दुरूपेण वयं ८ सप्ताहस्य आयुः चयनं कृतवन्तः यदा स्पष्टमाइटोकॉन्ड्रियाखण्डानां अभावेऽपि पीएनस्तरः अद्यापि अक्षुण्णः आसीत् (चित्रम् १ बी तथा चित्रम् एस१ ए)। कुलतः, वयं कुल 3013 प्रोटीनानां परिमाणं कृतवन्तः, येषु प्रायः 22% माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीओम आधारित MitoCarta 2.0 एनोटेशनानाम् आधारेण माइटोकॉन्ड्रिया (चित्र 1E) (चित्र 1E) (24) आसीत् 8 सप्ताहे कृते विभेदकजीनव्यञ्जनविश्लेषणेन ज्ञातं यत् सर्वेषां प्रोटीनानां केवलं 10.5% महत्त्वपूर्णपरिवर्तनं भवति (चित्रम् 1F तथा चित्रं S1F), येषु 195 प्रोटीनानि अधः-नियन्त्रितानि, 120 प्रोटीनानि अप-नियंत्रितानि च (चित्रम् 1F) ज्ञातव्यं यत् अस्य दत्तांशसमूहस्य “नवीनमार्गविश्लेषणेन” ज्ञायते यत् भिन्नरूपेण अभिव्यक्ताः जीनाः मुख्यतया विशिष्टचयापचयमार्गस्य प्रतिबन्धितसमूहस्य सन्ति (चित्रम् १जी) रोचकं तत् अस्ति यत्, यद्यपि OXPHOS तथा कैल्शियम-संकेत-सम्बद्धानां मार्गानाम् अधः-नियमनं संलयन-अभावयुक्तेषु PNs-मध्ये माइटोकॉन्ड्रिया-विकारस्य प्रेरणस्य पुष्टिं करोति, तथापि अन्यवर्गाः येषु मुख्यतया अमीनो-अम्ल-चयापचयः सम्मिलितः भवति, ते महत्त्वपूर्णतया अप-रेगुलेटेड् भवन्ति, यत् माइटोकॉन्ड्रिया-PNs-मध्ये घटमानस्य चयापचयस्य अनुरूपं भवति पुनः तारीकरणं सुसंगतं भवति। विकारः ।
(A) CTRL तथा Mfn2cKO चूहों के सेरेब्रल खण्डों के प्रतिनिधि confocal छायाचित्र PNs (calbindin, ग्रे) के प्रगतिशील हानि दिखाते हुए; नाभिकाः DAPI इत्यनेन प्रतिरञ्जिताः आसन् । (B) (A) (विचरणस्य एकदिशा विश्लेषणं, *** P <0.001; n = त्रयाणां मूषकाणां 4 तः 6 वृत्तानां) इत्यस्य मात्रानिर्धारणम्। (C) प्रयोगात्मककार्यप्रवाहः। (D) पुर्किन्जे (ऊर्ध्व) तथा अन्यकोशिकाप्रकारस्य (मध्यम्) विशिष्टानां चिह्नानां तापनक्शवितरणं। (E) वर्गीकृत पीएन मध्ये चिह्नितानां माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीनानां संख्यां दर्शयति वेन् आरेखम्। (F) 8 सप्ताहेषु Mfn2cKO न्यूरॉन्समध्ये विभेदितरूपेण अभिव्यक्तप्रोटीनानां ज्वालामुखीप्लॉट् (1.3 इत्यस्य महत्त्व-कट-ऑफ-मूल्यम्)। (G) रचनात्मकतामार्गविश्लेषणं 8 सप्ताहेषु वर्गीकृतेषु Mfn2cKO PN इत्यस्मिन् पञ्च महत्त्वपूर्णान् अप-रेगुलेशन (लाल) तथा डाउन-रेगुलेशन (नीला) मार्गान् दर्शयति। प्रत्येकस्य ज्ञातस्य प्रोटीनस्य औसतव्यञ्जनस्तरः दर्शितः अस्ति । ग्रेस्केल तापनक्शा: समायोजितं P मूल्यम्। नस्, न महत्त्वपूर्णम् ।
प्रोटीओमिक्स-दत्तांशैः ज्ञातं यत् प्रथम-तृतीय-चतुर्थ-संकुलयोः प्रोटीन-अभिव्यक्तिः क्रमेण न्यूनीभवति । परिसर I, III, IV च सर्वेषु आवश्यकाः mtDNA-एन्कोडेड् उप-एककाः आसन्, यदा तु परिसर II, यः केवलं परमाणु-सङ्केतितः आसीत्, मूलतः अप्रभावितः आसीत् (चित्रम् 2A तथा चित्रं S2A) . प्रोटीओमिक्सपरिणामानां अनुरूपं सेरिबेलर ऊतकखण्डानां इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री इत्यनेन ज्ञातं यत् पीएन इत्यस्मिन् परिसर IV इत्यस्य MTCO1 (माइटोकॉन्ड्रिया साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज उप-इकाई 1) उप-इकाई स्तरः क्रमेण न्यूनः अभवत् (चित्रम् 2 बी)। mtDNA-एन्कोडेड् उप-इकाई Mtatp8 महत्त्वपूर्णतया न्यूनीकृता आसीत् (चित्रम् S2A), यदा तु नाभिकीय-एन्कोडेड् एटीपी सिन्थेज उप-एककस्य स्थिर-स्थिति-स्तरः अपरिवर्तितः एव अभवत्, यत् ज्ञात-स्थिर-एटीपी-सिन्थेज-उप-सङ्घटन-F1-सङ्कुलस्य अनुरूपं भवति यदा mtDNA-अभिव्यक्तिः स्थिरः भवति निर्माणं सुसंगतं भवति। व्यत्यय (७) । वास्तविकसमयस्य बहुलकश्रृङ्खलाप्रतिक्रिया (qPCR) द्वारा क्रमबद्धेषु Mfn2cKO PNs मध्ये mtDNA स्तरस्य मूल्याङ्कनेन mtDNA प्रतिलिपिसङ्ख्यायां क्रमिकक्षयस्य पुष्टिः अभवत् नियन्त्रणसमूहस्य तुलने ८ सप्ताहेषु mtDNA स्तरस्य केवलं प्रायः २०% भागः एव अवशिष्टः आसीत् (चित्रम् २C) । एतेषां परिणामानां अनुरूपं, डीएनए-परिचयार्थं Mfn2cKO PNs इत्यस्य confocal microscopy staining माइटोकॉन्ड्रिया न्यूक्लिओटाइड्स् इत्यस्य समयनिर्भरं उपभोगं दर्शयति (चित्रम् 2D) अस्माभिः ज्ञातं यत् माइटोकॉन्ड्रियाप्रोटीनक्षयस्य तनावप्रतिक्रियायाश्च सम्बद्धाः केवलं केचन अभ्यर्थिनः अप-रेगुलेटेड् आसन्, येषु Lonp1, Afg3l2 तथा Clpx, तथा OXPHOS जटिलसङ्घटनकारकाः सन्ति एपोप्टोसिस् इत्यस्मिन् सम्बद्धानां प्रोटीनानां स्तरेषु कोऽपि महत्त्वपूर्णः परिवर्तनः न ज्ञातः (चित्रम् S2B) । तथैव अस्माभिः ज्ञातं यत् कैल्शियमपरिवहनं सम्बद्धेषु माइटोकॉन्ड्रिया तथा अन्तःप्लाज्मिकजालचैनलेषु केवलं लघुपरिवर्तनं भवति (चित्रम् S2C) । तदतिरिक्तं, आटोफेजी-सम्बद्धानां प्रोटीनानां मूल्याङ्कने कोऽपि महत्त्वपूर्णः परिवर्तनः न प्राप्तः, यत् इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तथा इलेक्ट्रॉनमाइक्रोस्कोपी द्वारा विवो इत्यत्र अवलोकितानां ऑटोफेगोसोमानां दृश्यमानप्रेषणेन सह सङ्गतम् अस्ति (चित्रम् S3) परन्तु पीएन-मध्ये प्रगतिशीलः OXPHOS-विकारः स्पष्ट-अतिसंरचनात्मक-माइटोकॉन्ड्रिया-परिवर्तनैः सह भवति । ५ तथा ८ सप्ताहेषु आयुषः Mfn2cKO PNs इत्यस्य कोशिकाशरीरेषु डेण्ड्रिटिकवृक्षेषु च माइटोकॉन्ड्रियासमूहाः दृश्यन्ते, तथा च आन्तरिकझिल्लीसंरचनायां गहनपरिवर्तनं जातम् (चित्रम् S4, A तथा B) एतेषां अतिसंरचनात्मकपरिवर्तनानां अनुरूपं तथा mtDNA इत्यस्मिन् महती न्यूनता, टेट्रामिथाइलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (TMRM) इत्यनेन सह तीव्रमस्तिष्कमस्तिष्कस्लाइसस्य विश्लेषणेन ज्ञातं यत् Mfn2cKO PNs इत्यस्मिन् माइटोकॉन्ड्रियाझिल्लीक्षमतायां महती न्यूनता अभवत् (चित्रम् S4C)।
(A) OXPHOS परिसरस्य अभिव्यक्तिस्तरस्य समयपाठ्यक्रमविश्लेषणम्। केवलं ८ सप्ताहेषु P<0.05 युक्तानि प्रोटीनानि (द्विपक्षीय ANOVA) विचारयन्तु । बिन्दुरेखा : CTRL इत्यस्य तुलने समायोजनं नास्ति । (B) वामभागे : एंटी-MTCO1 प्रतिपिण्डेन (scale bar, 20 μm) लेबलयुक्तस्य मस्तिष्ककोशिकस्य खण्डस्य उदाहरणम् । पुर्किन्जे कोष्ठपिण्डैः व्याप्तः क्षेत्रः पीतवर्णेन आच्छादितः अस्ति । दक्षिणः : MTCO1 स्तरस्य मात्रानिर्धारणम् (विचरणस्य एकदिशा विश्लेषणम्; n = 7 तः 20 कोशिकाभ्यः त्रयः मूषकेभ्यः विश्लेषिताः)। (C) क्रमबद्धे पीएन (विचरणस्य एकदिशा विश्लेषणम्; n = 3 तः 7 चूहों) मध्ये mtDNA प्रतिलिपिसङ्ख्यायाः qPCR विश्लेषणम्। (D) वामभागे : एण्टी-डीएनए प्रतिपिण्डेन (स्केल बार, 20 μm) लेबलयुक्तस्य मस्तिष्कस्य स्लाइस् इत्यस्य उदाहरणम् । पुर्किन्जे कोष्ठपिण्डैः व्याप्तः क्षेत्रः पीतवर्णेन आच्छादितः अस्ति । दक्षिणतः: mtDNA घावस्य मात्रानिर्धारणम् (विचरणस्य एकदिशा विश्लेषणम्; n = त्रयाणां मूषकाणां 5 तः 9 कोशिकानां)। (E) सम्पूर्ण-कोशिका-पैच-क्लैम्प-रिकार्डिंग्-मध्ये mitoYFP + Purkinje-कोशिकानां (बाणं) दर्शयति तीव्र-मस्तिष्क-खण्डस्य उदाहरणम्। (F) चतुर्थ वक्रस्य परिमाणीकरणम्। (G) CTRL तथा Mfn2cKO Purkinje कोशिकाओं में विध्रुवीकरण करंट इंजेक्शन के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। शीर्ष-लेशः : प्रथमः नाडी यः एपी-प्रवर्तनं कृतवान् । तल ट्रेस: ​​अधिकतम एपी आवृत्ति। (H) पोस्टसिनैप्टिक स्वतःस्फूर्त इनपुट (sPSPs) की मात्रा निर्धारण। प्रतिनिधिः अभिलेखन-लेशः तस्य जूम-अनुपातः च (I) मध्ये दर्शितः अस्ति । विचरणस्य एकदिशाविश्लेषणेन त्रयाणां मूषकाणां n = 5 तः 20 पर्यन्तं कोशिकानां विश्लेषणं कृतम् । दत्तांशः औसत±SEM इति रूपेण व्यक्तः भवति; *P<0.05; **पी <0.01; ***प <0.001। (J) छिद्रितपैचक्लैम्प मोडस्य उपयोगेन अभिलेखितस्य स्वतःस्फूर्त एपी इत्यस्य प्रतिनिधिलेशाः। शीर्ष ट्रेस: ​​अधिकतम एपी आवृत्ति। अधः ट्रेसः : एकस्य एपी इत्यस्य जूम् । (K) (J) इत्यस्य अनुसारं औसतं अधिकतमं च एपी आवृत्तिं परिमाणं कुर्वन्तु। मान-विट्नी परीक्षणम्; n = चतुर्णां मूषकाणां कृते 5 कोशिकानां विश्लेषणं कृतम्। दत्तांशः औसत±SEM इति रूपेण व्यक्तः भवति; न महत्त्वपूर्णम्।
८ सप्ताहस्य Mfn2cKO PN इत्यस्मिन् स्पष्टं OXPHOS क्षतिः ज्ञाता, यत् सूचयति यत् न्यूरॉन्सस्य शारीरिकं कार्यं गम्भीररूपेण असामान्यम् अस्ति । अतः, वयं तीव्र-मस्तिष्क-स्लाइस् (चित्र 2E) मध्ये सम्पूर्ण-कोशिका-पैच-क्लैम्प-रिकार्डिङ्गं कृत्वा 4 तः 5 सप्ताहेषु 7 तः 8 सप्ताहेषु च OXPHOS-अभावयुक्तानां न्यूरॉन्सस्य निष्क्रिय-विद्युत्-लक्षणानाम् विश्लेषणं कृतवन्तः अप्रत्याशितरूपेण, Mfn2cKO न्यूरॉन्सस्य औसतविश्रामझिल्लीविभवः निवेशप्रतिरोधः च नियन्त्रणस्य सदृशः आसीत्, यद्यपि कोशिकानां मध्ये सूक्ष्मभेदाः आसन् (सारणी १) तथैव ४ तः ५ सप्ताहेषु आयुषः वर्तमान-वोल्टेज-सम्बन्धे (IV वक्रम्) कोऽपि महत्त्वपूर्णः परिवर्तनः न प्राप्तः (चित्रम् २F) । परन्तु ७ तः ८ सप्ताहपर्यन्तं वयसि कोऽपि Mfn2cKO न्यूरॉन् IV-पद्धत्या (अतिध्रुवीकरण-पदार्थः) जीवितः न अभवत्, यत् सूचयति यत् अस्मिन् विलम्बेन अतिध्रुवीकरण-क्षमतायाः स्पष्टसंवेदनशीलता अस्ति तस्य विपरीतम्, Mfn2cKO न्यूरॉन्सेषु, पुनरावर्तनीयक्रियाविभवस्य (AP) निर्वहनस्य कारणं भवन्ति विध्रुवीकरणधाराः सम्यक् सहन्ते, येन सूचितं यत् तेषां समग्रनिर्वाहप्रतिमानाः 8 सप्ताहपुराणानां नियन्त्रणन्यूरोनानां अपेक्षया महत्त्वपूर्णरूपेण भिन्नाः न सन्ति (सारणी 1 तथा चित्रं 2G) तथैव स्वतःस्फूर्तपश्चात्सिनैप्टिकधाराणां (sPSCs) आवृत्तिः आयामश्च नियन्त्रणसमूहस्य तुलनीयः आसीत्, तथा च घटनानां आवृत्तिः ४ सप्ताहात् ५ सप्ताहपर्यन्तं ७ सप्ताहात् ८ सप्ताहपर्यन्तं समानवृद्ध्या सह वर्धिता (चित्रम् २, एच्, I च) पीएन (25) मध्ये सिनैप्टिक परिपक्वतायाः अवधिः । छिद्रित-पीएन्स्-पैच्-पश्चात् अपि एतादृशाः परिणामाः प्राप्ताः । एतत् विन्यासः कोशिकीय-एटीपी-दोषाणां सम्भाव्यं क्षतिपूर्तिं निवारयति, यथा सम्पूर्ण-कोशिका-पैच-क्लैम्प-अभिलेखने भवितुम् अर्हति । विशेषतः, Mfn2cKO न्यूरॉन्सस्य विश्रामझिल्लीक्षमता तथा स्वतःस्फूर्तप्रहारस्य आवृत्तिः प्रभाविता न अभवत् (चित्रम् २, जे तथा के)। सारांशेन, एते परिणामाः सूचयन्ति यत् स्पष्ट-OXPHOS-विकारयुक्ताः PNs उच्च-आवृत्ति-निर्वाह-प्रतिमानैः सह सम्यक् सामना कर्तुं शक्नुवन्ति, यत् सूचयति यत् एकः क्षतिपूर्ति-तन्त्रः अस्ति यः तेषां निकट-सामान्य-विद्युत्-शारीरिक-प्रतिक्रियाः निर्वाहयितुं शक्नोति
आँकडा औसत ± SEM (विचरणस्य एकदिशा विश्लेषणं, होल्म-सिडकस्य बहुतुलनपरीक्षा; * P <0.05) इति रूपेण व्यक्तानि सन्ति। एककसङ्ख्या कोष्ठकैः सूचिता भवति ।
वयं अन्वेष्टुं प्रस्थितवन्तः यत् प्रोटीओमिक्स-दत्तांशसमूहे (चित्रं 1G) कस्यापि वर्गे एतादृशाः मार्गाः समाविष्टाः सन्ति ये गम्भीर-OXPHOS-अभावस्य प्रतिकारं कर्तुं शक्नुवन्ति, अतः प्रभावितः PN-समीप-सामान्य-विद्युत्शरीर-विज्ञानं किमर्थं निर्वाहयितुं शक्नोति (चित्रम् 2, E तः K) इति व्याख्यायते . प्रोटीओमिक्स विश्लेषणेन ज्ञातं यत् शाखायुक्तशृङ्खला अमीनो अम्लस्य (BCAA) चयापचयस्य सम्बद्धाः एन्जाइमाः महत्त्वपूर्णतया अप-रेगुलेटाः आसन् (चित्रम् 3A तथा चित्रं S5A), तथा च अन्तिमः उत्पादः एसिटाइल-कोए (CoA) अथवा सुक्सिनिल कोए धमनीकाठिन्य अम्लस्य (TCA) चक्रस्य त्रिकार्बोक्जिलेट्-पूरकं कर्तुं शक्नोति। अस्माभिः ज्ञातं यत् BCAA transaminase 1 (BCAT1) तथा BCAT2 इत्येतयोः द्वयोः अपि सामग्री वर्धिता । ते α-कीटोग्लूटारेट् (26) तः ग्लूटामेट् उत्पन्नं कृत्वा BCAA चयापचयस्य प्रथमपदं उत्प्रेरकं कृतवन्तः । शाखायुक्तशृङ्खलाकीटो अम्लविहाइड्रोजनेज (BCKD) परिसरं निर्मायन्ते ये सर्वे उप-इकाईः ते अपरेगुलेटेड् भवन्ति (संकुलं परिणामी BCAA कार्बनकंकालस्य अनन्तरं अपरिवर्तनीयं च डिकार्बोक्जिलेशनं उत्प्रेरकं करोति) (चित्रं 3A तथा चित्रं S5A) परन्तु क्रमबद्धे पीएन-मध्ये बीसीएए-मध्ये एव कोऽपि स्पष्टः परिवर्तनः न प्राप्तः, यत् एतेषां आवश्यक-अमीनो-अम्लानां कोशिकीय-उपभोगस्य वर्धनस्य वा टीसीए-चक्रस्य पूरकत्वेन अन्यस्रोतानां (ग्लूकोज-अथवा लैक्टिक-अम्लस्य) उपयोगस्य कारणं भवितुम् अर्हति (चित्रम् S5B) OXPHOS इत्यस्य अभावयुक्तेषु PNs इत्यनेन 8 सप्ताहेषु ग्लूटामाइन् अपघटनं तथा च ट्रांसएमिनेशनक्रियाकलापाः अपि वर्धिताः, यत् माइटोकॉन्ड्रिया एन्जाइम्स् ग्लूटामिनेज (GLS) तथा ग्लूटामाइन् पाइरुवेट् ट्रांसएमिनेज् 2 (GPT2) इत्येतयोः अप-रेगुलेशनेन प्रतिबिम्बितुं शक्यते (चित्रम् 3, ए तथा सी)। ज्ञातव्यं यत् GLS इत्यस्य अप-रेगुलेशनं स्प्लिस्ड आइसोफॉर्म ग्लूटामिनेज C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL इत्यस्य परिवर्तनं प्रायः 4.5-गुणं, P = 0.05) यावत् सीमितं भवति, तथा च कैंसर ऊतकयोः तस्य विशिष्टं अप-रेगुलेशनं माइटोकॉन्ड्रिया जैव ऊर्जायाः समर्थनं कर्तुं शक्नोति (27) इति ।
(A) तापनक्शे 8 सप्ताहेषु निर्दिष्टमार्गस्य प्रोटीनस्तरस्य गुनापरिवर्तनं दर्शयति। (B) एण्टी-PCx प्रतिपिण्डेन (स्केल बार, 20 μm) लेबलयुक्तस्य मस्तिष्कस्य स्लाइस् इत्यस्य उदाहरणम्। पीतः बाणः पुर्किन्जे कोशिकाशरीरं दर्शयति । (C) समय पाठ्यक्रम प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण धमनीकाठिन्य (बहु टी-परीक्षण, * FDR <5%; n = 3-5 चूहों) के लिए एक महत्वपूर्ण उम्मीदवार के रूप में चिह्नित। (D) उपरि: [1-13C]पाइरुवेट् ट्रेसरमध्ये निहितस्य लेबलयुक्तस्य कार्बनस्य प्रवेशस्य विभिन्नमार्गान् दर्शयति योजनाबद्धचित्रम् (अर्थात् PDH अथवा ट्रांस-धमनीमार्गेण)। तलम् : वायलिन-चार्ट् [1-13C]पाइरुवेट् (युग्मित-टी-परीक्षा; ** P <0.01) इत्यनेन तीव्र-मस्तिष्क-स्लाइस्-इत्येतत् लेबलं कृत्वा एस्पार्टिक-अम्लम्, साइट्रिक-अम्लम्, मैलिक-अम्लम् च परिवर्तितस्य एकल-लेबल-कृतस्य कार्बनस्य (M1) प्रतिशतं दर्शयति (ङ) सूचितमार्गस्य व्यापकं काल-इतिहास-विश्लेषणम्। केवलं 8 सप्ताहे P<0.05 युक्तानि प्रोटीनानि विचारयन्तु . डैश रेखा: समायोजनमूल्यं नास्ति (विचरणस्य द्विपक्षीयविश्लेषणम्; * P <0.05; *** P <0.001)। दत्तांशः औसत±SEM इति रूपेण व्यक्तः भवति।
अस्माकं विश्लेषणे बीसीएए-उत्चयवादः प्रमुखेषु अप-रेगुलेशन-मार्गेषु अन्यतमः अभवत् । एतत् तथ्यं दृढतया सूचयति यत् TCA चक्रं प्रविशन्तं वायुप्रवाहस्य आयतनं OXPHOS अभावे PN मध्ये परिवर्तयितुं शक्यते। इदं न्यूरॉनल मेटाबोलिक रिवाइरिंग् इत्यस्य प्रमुखरूपं प्रतिनिधितुं शक्नोति, यस्य प्रत्यक्षः प्रभावः न्यूरॉनल फिजियोलॉजी इत्यत्र तथा च गम्भीरस्य OXPHOS विकारस्य निर्वाहस्य समये भवितुं शक्नोति अस्याः परिकल्पनायाः अनुरूपं, अस्माभिः ज्ञातं यत् मुख्यः धमनीकाठिन्यविरोधी एन्जाइमः PCx अप-रेगुलेटेड् अस्ति (Mfn2cKO/CTRL प्रायः 1.5 गुणान् परिवर्तते; चित्रं 3A), यत् पाइरुवेट् इत्यस्य ओक्सालोएसिटेट् (28) इति परिवर्तनं उत्प्रेरकं करोति, यत् मस्तिष्कस्य ऊतकयोः इति विश्वासः अस्ति The expression in is restricted to astrocytes (29, 30). प्रोटीओमिक्सपरिणामानां अनुरूपं, कन्फोकलसूक्ष्मदर्शनेन ज्ञातं यत् OXPHOS-अभावयुक्तेषु PNs मध्ये PCx अभिव्यक्तिः विशेषतया महत्त्वपूर्णतया च वर्धिता आसीत्, यदा तु PCx प्रतिक्रियाशीलता मुख्यतया नियन्त्रणस्य समीपस्थेषु Bergmann glial कोशिकासु प्रतिबन्धिता आसीत् (चित्रम् 3B)। PCx इत्यस्य अवलोकितस्य अपरेग्यूलेशनस्य कार्यात्मकरूपेण परीक्षणार्थं वयं [1-13C]pyruvate tracer इत्यनेन तीव्रमस्तिष्कस्लाइस् इत्यस्य उपचारं कृतवन्तः। यदा पाइरुवेट् पाइरुवेट् डिहाइड्रोजनेज (PDH) द्वारा आक्सीकरणं कृतम् आसीत्, तदा तस्य समस्थानिकलेबलं अन्तर्धानं जातम् , परन्तु यदा पाइरुवेट् नाडीविक्रियाभिः चयापचयितः भवति तदा TCA चक्रस्य मध्यवर्तीषु समावेशः भवति (चित्रम् 3D)। अस्माकं प्रोटीओमिक्स-दत्तांशस्य समर्थने अस्माभिः Mfn2cKO-स्लाइस्-मध्ये एस्पार्टिक-अम्ले अस्मात् ट्रेसर-तः बहूनां चिह्नानां अवलोकनं कृतम्, यदा तु सिट्रिक-अम्लस्य, मैलिक-अम्लस्य च मध्यमप्रवृत्तिः आसीत्, यद्यपि महत्त्वपूर्णा नासीत् (चित्रम् 3D)
विशेषरूपेण माइटोकॉन्ड्रिया-प्रतिलेखनकारक ए जीन (Tfam) (चित्रं S6B) नष्टं कुर्वन्तः डोपामाइन् न्यूरॉन्सस्य कारणेन माइटोकॉन्ड्रिया-विकारयुक्तेषु माइटोपार्क-मूषकेषु डोपामाइन्-न्यूरोनेषु PCx-अभिव्यक्तिः अपि महत्त्वपूर्णतया अप-रेगुलेटेड् आसीत् (31), यत् सूचयति यत् एसीटोन-अम्ल-धमनीकाठिन्यः न्यूरॉनल-विकारस्य समये रोगस्य घटना नियन्त्रिता भवति शरीरे OXPHOS इति । ज्ञातव्यं यत् एतत् ज्ञातं यत् अद्वितीयाः एन्जाइमाः (32-34) ये न्यूरॉन्स-मध्ये अभिव्यक्ताः भवितुम् अर्हन्ति ये धमनीकाठिन्येन सह सम्बद्धाः भवितुम् अर्हन्ति, ते OXPHOS-अभावयुक्तेषु PN-मध्ये महत्त्वपूर्णतया अप-रेगुलेटाः भवन्ति, यथा प्रोपिओनिल्-कोए कार्बोक्जिलेज (PCC-A), मेलोनिल्-कोए प्रोपिओनिल्-कोए-इत्येतत् सुक्सिनिल-कोए तथा माइटोकॉन्ड्रिया-मैलिक एन्जाइम 3 (ME3), यस्य मुख्या भूमिका मेलेट् इत्यस्मात् पाइरुवेट् इत्यस्य पुनः प्राप्तिः भवति (चित्रम् ३, क, ग) (३३, ३५) । तदतिरिक्तं, अस्माभिः Pdk3 एन्जाइमस्य महती वृद्धिः ज्ञाता, यः फॉस्फोरिलेट् करोति तथा च PDH (36) निष्क्रियं करोति, यदा तु PDH सक्रिययति इति Pdp1 एन्जाइमे अथवा स्वयं PDH एन्जाइम परिसरे कोऽपि परिवर्तनः न ज्ञातः (चित्र 3A)। निरन्तरं, Mern2cKO PNs इत्यस्मिन्, Ser293 इत्यस्मिन् PDH परिसरस्य पाइरुवेट् डिहाइड्रोजनेज E1 घटकस्य α1 उप-इकाई α (PDHE1α) उप-एककस्य फॉस्फोरिलेशनं वर्धितम् (चित्रम् S6C) (चित्रम् S6C) पाइरुवेट् इत्यस्य नाडीप्रवेशः नास्ति ।
अन्ते, अस्माभिः ज्ञातं यत् सेरिन् तथा ग्लाइसिन जैवसंश्लेषणस्य सुपर मार्गः, सम्बन्धितः माइटोकॉन्ड्रिया फोलेट् (1C) चक्रः तथा प्रोलाइन जैवसंश्लेषणं (चित्रं 1G तथा चित्रं S5C) सर्वे सक्रियीकरणप्रक्रियायाः समये, रिपोर्टानुसारं, महत्त्वपूर्णतया अप-रेगुलेटेड् भवन्ति। परितः ऊतकाः माइटोकॉन्ड्रिया-विकारेन सक्रियाः भवन्ति (५-७) । एतेषां प्रोटीओमिक्स-आँकडानां समर्थनं कृत्वा कॉनफोकल-विश्लेषणेन ज्ञातं यत् OXPHOS-अनुपलब्ध-सहितं PN-मध्ये 8-सप्ताह-पुराणानां मूषकाणां सेरिबेलर-स्लाइस्-इत्येतत् माइटोकॉन्ड्रिया-फोलेट्-चक्रस्य प्रमुख-एन्जाइम-सेरिन्-हाइड्रोक्सीमिथाइलट्रांसफरेज्-2 (SHMT2) इत्यस्य अधीनम् अभवत् महत्त्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (चित्र S5D)। 13 CU-ग्लूकोज-इन्क्यूबेट् तीव्र-मस्तिष्क-स्लाइस् मध्ये, चयापचय-अनुसन्धान-प्रयोगैः सेरिन्-प्रोलिन-जैव-संश्लेषणस्य अप-रेगुलेशनस्य अग्रे पुष्टिः अभवत्, यत् सूचयति यत् सेरिन्-प्रोलिन-योः कार्बन-समरूपस्य प्रवाहः वर्धितः (चित्रम् S5E) यतो हि GLS तथा GPT2 द्वारा प्रवर्धिताः प्रतिक्रियाः ग्लूटामाइनतः ग्लूटामेटस्य संश्लेषणाय तथा ग्लूटामेट् तथा α-कीटोग्लूटारेट् इत्येतयोः मध्ये ट्रांसएमिनेशनस्य उत्तरदायी भवन्ति, तेषां अपरेग्युलेशनं सूचयति यत् OXPHOS-अभावयुक्तानां न्यूरॉन्सानाम् ग्लूटामेटस्य महती वर्धिता अस्ति , एतस्य उद्देश्यं प्रोलिनस्य वर्धितं जैवसंश्लेषणं निर्वाहयितुम् भवितुम् अर्हति (चित्रं S5C)। एतेषां परिवर्तनानां विपरीतम्, PN-विशिष्ट Mfn2cKO मूषकाणां मस्तिष्ककोशिकानां प्रोटीओमिकविश्लेषणेन ज्ञातं यत् एते मार्गाः (सर्व-एण्टीपेरोक्साइडेज-सहिताः) अभिव्यक्ति-रूपेण महत्त्वपूर्णं परिवर्तनं न कृतवन्तः, अतः एतत् प्रदर्शयति यत् एतत् चयापचय-पुनर्निर्देशनं क्षीण-पीएन-कृते चयनात्मकम् अस्ति (चित्रम् S6, D तः G)
सारांशेन, एतेषु विश्लेषणेषु पीएन-मध्ये विशिष्टचयापचयमार्गस्य अस्थायीसक्रियीकरणस्य महत्त्वपूर्णरूपेण भिन्नाः प्रतिमानाः प्रकाशिताः । यद्यपि असामान्यं न्यूरॉनल माइटोकॉन्ड्रियाकार्यं प्रारम्भिकधमनीकाठिन्यस्य 1C पुनर्निर्माणस्य च कारणं भवितुम् अर्हति (चित्रं 3E तथा चित्रं S5C), तथा च I तथा IV परिसरयोः अभिव्यक्तिः पूर्वानुमानीयपरिवर्तनानि अपि, सेरिन डी नोवो संश्लेषणे परिवर्तनं केवलं केवलं उत्तरपदेषु एव स्पष्टं जातम् OXPHOS विकार (चित्र 3E तथा चित्र S5C)। एते निष्कर्षाः एकां क्रमिकप्रक्रियाम् परिभाषयन्ति यस्मिन् तनाव-प्रेरिताः माइटोकॉन्ड्रिया (1C चक्र) तथा कोशिका द्रव्य (सेरिन जैवसंश्लेषण) च न्यूरॉनल चयापचयस्य पुनः आकारं दातुं टीसीए चक्रस्य धमनीकाठिन्यस्य वृद्ध्या सह समन्वयात्मकरूपेण प्रतिक्रियां ददति
८ सप्ताहस्य OXPHOS-अभावयुक्ताः PNs उच्च-आवृत्ति-उत्तेजन-क्रियाकलापं निर्वाहयितुं शक्नुवन्ति तथा च माइटोकॉन्ड्रिया-विकारस्य क्षतिपूर्तिं कर्तुं महत्त्वपूर्णं चयापचय-पुनः संयोजनं कर्तुं शक्नुवन्ति एषा आविष्कारः एकां रोचकसंभावनां उत्थापयति यत् अस्मिन् क्षणे अपि एताः कोशिका: न्यूरोडिजनरेशनं विलम्बयितुं वा निवारयितुं वा चिकित्साहस्तक्षेपं प्राप्तुं शक्नुवन्ति। विलम्बेन। वयं स्वतन्त्रहस्तक्षेपद्वयेन एतस्याः सम्भावनायाः समाधानं कृतवन्तः। प्रथमे पद्धत्या वयं Cre-निर्भरं एडेनो-सम्बद्धं वायरस (AAV) वेक्टरं डिजाइनं कृतवन्तः येन MFN2 इत्यस्य चयनात्मकरूपेण OXPHOS-अभावयुक्तेषु PNs इत्यत्र in vivo (चित्रं S7A) अभिव्यक्तं कर्तुं शक्यते। MFN2 एन्कोडिंग् AAV तथा फ्लोरोसेन्ट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) इत्येतयोः सत्यापनम् प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतिषु विट्रो इत्यत्र कृतम्, येन MFN2 Cre-निर्भररूपेण अभिव्यक्तः अभवत् तथा च माइटोकॉन्ड्रिया आकृतिविज्ञानस्य उद्धारः अभवत्, येन Mfn2cKO न्यूरॉन्सेषु न्यूरोम्यूटेशनं निवारितम् ( चित्रम् S7, B, D तथा E) तदनन्तरं, वयं Mfn2cKO तथा नियन्त्रणमूषकाणां मस्तिष्ककोशिकायां 8-सप्ताह-पुराण-Mfn2-AAV-इत्येतत् रूढिगतरूपेण वितरितुं विवो-प्रयोगान् कृतवन्तः, 12-सप्ताह-पुराण-मूषकाणां विश्लेषणं च कृतवन्तः (चित्रम् 4A)। उपचारिताः Mfn2cKO मूषकाः मृताः (चित्रम् १, क, ख च) (१६) । विवो इत्यस्मिन् वायरल-संप्रेषणस्य परिणामेण केषुचित् मस्तिष्क-वृत्तेषु पीएन-इत्यस्य चयनात्मक-अभिव्यक्तिः अभवत् (चित्रम् S7, G तथा H) । केवलं mCherry (Ctrl-AAV) अभिव्यक्तं नियन्त्रण AAV इत्यस्य इन्जेक्शनस्य Mfn2cKO पशुषु न्यूरोडिजनरेशनस्य डिग्रीयां कोऽपि महत्त्वपूर्णः प्रभावः नासीत् । तस्य विपरीतम्, Mfn2-AAV इत्यनेन सह परिवर्तितानां Mfn2cKOs इत्यस्य विश्लेषणेन PN कोशिकास्तरस्य महत्त्वपूर्णः सुरक्षात्मकः प्रभावः दर्शितः (चित्रम् 4, B तथा C)। विशेषतः न्यूरॉन् घनत्वं नियन्त्रणपशूभ्यः प्रायः अभेद्यं दृश्यते (चित्रम् ४, ख, ग, चित्रं च एस७, एच्, I च) । MFN1 इत्यस्य अभिव्यक्तिः परन्तु MFN2 इत्यस्य न तु न्यूरॉनलमृत्युं रक्षितुं समानरूपेण प्रभावी भवति (चित्रं 4C तथा चित्रं S7, C तथा F), यत् सूचयति यत् एक्टोपिक MFN1 इत्यस्य अभिव्यक्तिः MFN2 इत्यस्य अभावस्य प्रभावीरूपेण पूरकं कर्तुं शक्नोति। एकल पीएन स्तरस्य अग्रे विश्लेषणेन ज्ञातं यत् Mfn2-AAV इत्यनेन माइटोकॉन्ड्रियायाः अल्ट्रास्ट्रक्चरं बहुधा उद्धारितं, mtDNA स्तरं सामान्यीकृत्य, एण्टी-एन्जिओजेनेसिस मार्कर PCx इत्यस्य उच्चव्यञ्जनं विपर्ययितम् (चित्रम् 4, C तः E पर्यन्तं) विश्रामस्थितौ उद्धारितानां Mfn2cKO मूषकाणां दृश्यनिरीक्षणेन ज्ञातं यत् तेषां मुद्रा तथा मोटरलक्षणयोः (S1 तः S3 पर्यन्तं गतिः) सुधारः अभवत् निष्कर्षतः एते प्रयोगाः दर्शयन्ति यत् OXPHOS इत्यस्मिन् गम्भीररूपेण अभावयुक्तेषु PNs मध्ये MFN2 इत्यस्य विलम्बितः पुनः प्रवेशः mtDNA सेवनं विपर्ययितुं धमनीकाठिन्यस्य प्रेरणायै पर्याप्तः अस्ति, येन अक्षतंतुक्षयः न्यूरॉनल मृत्युः च विवो इत्यत्र निवारितः भवति
(A) सूचितचयापचयमार्गः सक्रियः भवति चेत् MFN2 एन्कोडिंग् AAV इत्यस्य इन्जेक्शनस्य प्रयोगात्मकं समयसूचीं दर्शयति योजना। (B) 8 सप्ताहे Mfn2cKO चूहैः सह परिवर्तितानां 12-सप्ताह-पुराणानां मस्तिष्ककोशिकानां खण्डानां प्रतिनिधि-संकेन्द्रीय-छायाचित्रं तथा च एंटी-कैल्बिण्डिन-प्रतिपिण्डेन लेबलं कृतम्। दक्षिणतः : अक्षतंतुतन्तुनां स्केलिंग्। अक्षतंतुजूमस्य स्केलः ४५० तथा ७५ माइक्रोमीटर् भवति । (C) बाम: एएवी संप्रेषण पाश (एएवी +) (विचरणस्य एकदिशा विश्लेषण; n = 3 चूहों) इत्यस्मिन् पुर्किन्जे कोशिका घनत्वस्य मात्रानिर्धारणम्। दक्षिण: 12 सप्ताहे परिवर्तित पीएन (अयुग्मित टी-परीक्षण; n = 6 कोशिकाओं त्रयाणां मूषकाणां) मध्ये mtDNA फोकस विश्लेषण। * पी <0.05; ** पी <0.01। (D) संकेतित वायरल सञ्चारकैः सह परिवर्तितानां Mfn2cKO मस्तिष्ककोशिकाखण्डानां PNs इत्यस्य प्रतिनिधिसंचरण इलेक्ट्रॉनसूक्ष्मचित्रम्। गुलाबी-मास्कः डेण्ड्राइट्-इत्यनेन आक्रान्तं क्षेत्रं दर्शयति, पीत-बिन्दुयुक्तः वर्गः च दक्षिणतः प्रदत्तं जूम-चित्रं दर्शयति; n नाभिकं प्रतिपादयति । स्केल बार, 1μm। (E) 12 सप्ताहेषु परिवर्तिते PN इत्यस्मिन् PCx-रञ्जनस्य उदाहरणं दर्शयति । स्केल बार, 20μm। ओई, अतिअभिव्यक्तिः; एफसी, गुना परिवर्तन।
अन्ते वयं OXPHOS-विकारस्य अनुभवं कृतवन्तः पीएन-मध्ये पेरोक्साइडेज-प्रेरित-कोशिका-जीवनस्य महत्त्वस्य अन्वेषणं कृतवन्तः । वयं विशेषतया माउस PCx mRNA (AAV-shPCx) लक्ष्यं कृत्वा AAV-shRNA (short hairpin RNA) एन्कोडिंगं mCherry उत्पन्नवन्तः, तथा च Mfn2cKO मूषकाणां मस्तिष्ककोशिकायां वायरसं वा तस्य स्क्रैम्बल्ड् नियन्त्रणं (AAV-scr) इन्जेक्शनं कृतवन्तः। यदा PCx अभिव्यक्तिः वर्धिता (चित्रं 3C) तथा च PN कोशिकास्तरः अद्यापि अक्षुण्णः आसीत् (चित्र 1A) तस्मिन् अवधिमध्ये प्रभावी PCx नॉकडाउनं प्राप्तुं आयुः चतुर्थे सप्ताहे (चित्र 5A) इन्जेक्शनं कृतम् ज्ञातव्यं यत् PCx (चित्रं S8A) पातयित्वा PN मृत्युः महत्त्वपूर्णं त्वरणं भवति, यत् संक्रमणस्य एकमात्रं प्रतिबन्धितं वलयम् अस्ति (चित्रम् 5, B, C) PCx अप-रेगुलेशन द्वारा प्रेरित चयापचयप्रभावस्य तन्त्रं अवगन्तुं, अस्माभिः PCx नॉकडाउनस्य अनन्तरं PNs इत्यस्य redox स्थितिः अध्ययनं कृतम् तथा च AAV-मध्यस्थतायुक्तं ऑप्टिकल बायोसेंसर Grx1-roGFP2 एकत्रैव व्यक्तं कृतम् (चित्रम् S8, B तः D) ग्लूटाथियोनस्य मूल्याङ्कनार्थं पेप्टाइड रेडॉक्स क्षमतायाः सापेक्षिकपरिवर्तनम् (38)। ततः, वयं FLIM-स्थितीनां सत्यापनस्य अनन्तरं कोशिका-द्रव्य-रेडॉक्स-स्थितौ सम्भाव्य-परिवर्तनस्य अन्वेषणार्थं 7-सप्ताह-पुराणस्य Mfn2cKO-इत्यस्य तीव्र-मस्तिष्क-स्लाइस्-मध्ये द्वि-फोटॉन-प्रतिदीप्ति-जीवन-प्रतिबिम्ब-सूक्ष्मदर्शनं (FLIM) कृतवन्तः विश्लेषणेन PCx अभिव्यक्तिस्य अभावस्य एकस्य Mfn2cKO PNs इत्यस्य आक्सीकरणस्थितौ महती वृद्धिः दृश्यते, यत् केवलं scrambled shRNA अभिव्यक्तं कृत्वा नियन्त्रण न्यूरॉन्स अथवा Mfn2cKO PNs इत्यस्मात् भिन्नम् अस्ति (चित्रम् 5, D तथा E)। यदा PCx अभिव्यक्तिः डाउन-रेगुलेटेड् आसीत्, तदा अत्यन्तं आक्सीकृता अवस्थां दर्शयन्तः Mfn2cKO PNs इत्यस्य प्रतिशतं त्रिगुणाधिकं वर्धितम् (चित्रम् 5E), यत् सूचयति यत् PCx अप-रेगुलेशनेन क्षीण न्यूरॉन्सस्य रेडॉक्स क्षमता निर्वाहिता
(A) सूचित चयापचयमार्गः सक्रियः भवति चेत् shPCx एन्कोडिंग् AAV इन्जेक्शनस्य प्रयोगात्मकं समयसूचीं दर्शयति योजना। (B) Mfn2cKO मूषकेषु 8 सप्ताहस्य सेरिबेलर-खण्डानां प्रतिनिधि-सङ्केत-चित्र-चित्रं 4 सप्ताहेषु एण्टी-कैल्सीन्यूरिन्-प्रतिपिण्डेन सह परिवर्तितं तथा लेबलं कृतम्। स्केल बार, 450μm। (C) एएवी-परिवर्तित पाशेषु पुर्किन्जे कोशिका घनत्वस्य मात्रानिर्धारणं (विचरणस्य एकदिशा विश्लेषणम्; n = 3 तः 4 चूहों)। दत्तांशः औसत±SEM इति रूपेण व्यक्तः भवति; ***प <0.001। (D) प्रतिनिधि FLIM चित्रं निर्दिष्टप्रयोगात्मकस्थितौ ग्लूटाथियोन रेडॉक्ससंवेदकं Grx1-roGFP2 अभिव्यक्तं 7 सप्ताहस्य PN इत्यस्य औसतजीवनकालं दर्शयति। LUT (लुक-अप सारणी) अनुपातः : जीवितस्य समयान्तरं (पिकोसेकेण्ड् मध्ये)। स्केल बार, 25μm। (E) हिस्टोग्रामः (D) तः Grx1-roGFP2 आयुषः मूल्यानां वितरणं दर्शयति (n=158 तः 368 कोशिकापर्यन्तं प्रत्येकं परिस्थितौ द्वयोः मूषकयोः)। प्रत्येकस्य हिस्टोग्रामस्य उपरि पाई चार्टः: महत्त्वपूर्णतया दीर्घकालं (लाल, आक्सीकृत) अथवा लघु (नीला, न्यूनीकृत) आयुः मूल्यैः सह कोशिकानां संख्यां दर्शयति, ये CTRL-AAV-scr इत्यस्मिन् औसत आयुः मूल्यस्य 1 SD अधिकं भवन्ति (F) प्रस्तावितं प्रतिरूपं न्यूरॉनल PCx इत्यस्य अपरेग्यूलेशनस्य सुरक्षात्मकं प्रभावं दर्शयति।
सर्वेषु सर्वेषु, अत्र वयं यत् आँकडा प्रदास्यामः तत् दर्शयति यत् MFN2 इत्यस्य पुनः अभिव्यक्तिः गम्भीर OXPHOS-अभावेन, गम्भीर-mtDNA-क्षयेन, अत्यन्तं असामान्य-ista-सदृश-आकृति-विज्ञानेन च उन्नत-PN-इत्यस्य पूर्णतया उद्धारं कर्तुं शक्नोति, येन उन्नत-रोगेषु अपि निरन्तरं प्रगतिः प्राप्यते तंत्रिकाक्षयः कोशिकामृत्युपूर्वस्य चरणस्य प्रतिवर्तनीयं प्रमाणं ददाति । चयापचयस्य लचीलतायाः एषा डिग्री न्यूरॉन्सस्य धमनीकाठिन्य (TCA चक्रस्य पुनः तारीकरणं) प्रेरयितुं क्षमतायाः कारणेन अधिकं बलं दत्तं भवति, यत् OXPHOS अभावयुक्तेषु PNs मध्ये PCx अभिव्यक्तिं निरुद्धं करोति तथा च कोशिकामृत्युं वर्धयति, तस्मात् रक्षात्मकां भूमिकां निर्वहति (चित्रम् 5F)
अस्मिन् अध्ययने अस्माभिः प्रमाणं प्रदत्तं यत् OXPHOS विकारस्य प्रति PNs इत्यस्य प्रतिक्रिया चयापचयकार्यक्रमैः सक्रियस्य विभेदकसक्रियीकरणमार्गस्य माध्यमेन क्रमेण TCA चक्रस्य धमनीकाठिन्यस्य अभिसरणं भवति। वयं बहुभिः पूरकविधिभिः प्रोटीओमिकविश्लेषणस्य पुष्टिं कृतवन्तः तथा च ज्ञातवन्तः यत् यदा गम्भीरमाइटोकॉन्ड्रियाविकारेन आव्हानं प्राप्नोति तदा न्यूरॉन्सस्य चयापचयलोचनस्य पूर्वं अज्ञातं रूपं भवति। अस्माकं आश्चर्यं यत्, सम्पूर्णा तारीकरणप्रक्रिया अनिवार्यतया न्यूरोडीजनरेशनस्य सह क्रमेण अपरिवर्तनीयरूपेण च गच्छन्तीं अन्तिमचयापचयस्थितिं न चिह्नयति, परन्तु अस्माकं आँकडानि सूचयन्ति यत् कोशिकामृत्युपूर्वपदे अपि एतत् अनुरक्षणन्यूरॉनस्य गठनं कर्तुं शक्नोति कार्यात्मकक्षतिपूर्तितन्त्रम्। एतत् निष्कर्षं सूचयति यत् न्यूरॉन्सस्य शरीरे चयापचयप्लास्टिसिटी पर्याप्तं भवति । एतत् तथ्यं सिद्धयति यत् MFN2 इत्यस्य पश्चात् पुनः परिचयः प्रमुखचयापचयचिह्नानां अभिव्यक्तिं विपर्ययितुं शक्नोति तथा च PN क्षयः निवारयितुं शक्नोति । प्रत्युत धमनीकाठिन्यं निवारयति, तंत्रिकानां त्वरिततां च करोति । हिजड़ा।
अस्माकं शोधकार्य्ये एकः आकर्षकः निष्कर्षः अस्ति यत् OXPHOS इत्यस्य अभावयुक्ताः PNs विशेषतया धमनीकाठिन्यस्य उत्तेजनं कुर्वन्तः एन्जाइम्स् अप-रेगुलेटिङ्ग् कृत्वा TCA चक्रचयापचयं परिवर्तयितुं शक्नुवन्ति। चयापचयात्मकपुनर्व्यवस्थापनं कर्करोगकोशिकानां सामान्यविशेषता अस्ति, येषु केचन न्यूनीकरणसमतुल्यानां उत्पादनार्थं TCA चक्रमध्यस्थानां पूरकत्वेन ग्लूटामाइनस्य उपरि निर्भराः भवन्ति, ये श्वसनशृङ्खलां चालयन्ति तथा च लिपिडस्य न्यूक्लिओटाइड् जैवसंश्लेषणपूर्ववर्तीनां च उत्पादनं निर्वाहयन्ति (39 , 40) अद्यतनेन अध्ययनेन ज्ञातं यत् OXPHOS-विकारं अनुभवन्तः परिधीय-उतकेषु ग्लूटामाइन्/ग्लूटामेट-चयापचयस्य पुनः संयोजनम् अपि प्रमुखं विशेषता अस्ति (5, 41), यत्र TCA-चक्रे ग्लूटामाइन्-प्रवेशस्य दिशा Because of the severity of OXPHOS injury (41) इत्यस्य उपरि निर्भरं भवति ). परन्तु शरीरे न्यूरॉनल चयापचयप्लास्टिसिटी इत्यस्य किमपि साम्यं रोगसन्दर्भे तस्य सम्भाव्यसान्दर्भिकतायाः च स्पष्टसाक्ष्यस्य अभावः अस्ति एकस्मिन् हाले एव इन विट्रो अध्ययने प्राथमिककोर्टिकल न्यूरॉन्सः न्यूरोट्रांसमिशनार्थं ग्लूटामेट् पूलान् संयोजयन्ति इति दर्शितम्, येन चयापचयतनावस्थितौ आक्सीडेटिव चयापचयस्य धमनीकाठिन्यस्य च प्रवर्धनं भवति ( 42 ). ज्ञातव्यं यत् TCA चक्र एन्जाइमस्य औषधशास्त्रीयनिरोधस्य अन्तर्गतं पाइरुवेट् कार्बोक्जिलेशनं संवर्धितेषु सेरिबेलर-कणिका-न्यूरोनेषु आक्सालोएसिटेट्-संश्लेषणं निर्वाहयति इति विश्वासः अस्ति (34) परन्तु मस्तिष्कस्य ऊतकयोः प्रति एतेषां तन्त्राणां शारीरिकसान्दर्भिकता (यत्र धमनीकाठिन्यः मुख्यतया खगोलकोशिकासु एव सीमितः इति मन्यते) अद्यापि महत्त्वपूर्णं शारीरिकं महत्त्वं वर्तते (४३) अस्मिन् सन्दर्भे अस्माकं आँकडा दर्शयति यत् शरीरे OXPHOS द्वारा क्षतिग्रस्ताः PNs BCAA अपघटनं तथा पाइरुवेट् कार्बोक्जिलेशनं प्रति स्विच् कर्तुं शक्यन्ते, ये TCA पूल मध्यवर्तीनां पूरकस्य मुख्यौ स्रोतौ स्तः यद्यपि न्यूरॉनल ऊर्जा चयापचयस्य कृते BCAA चयापचयस्य कथितं योगदानं प्रस्तावितं अस्ति तथापि न्यूरोट्रांसमिशनस्य कृते ग्लूटामेट् तथा GABA इत्येतयोः भूमिकायाः ​​अतिरिक्तं ( 44 ), अद्यापि एतेषां तन्त्राणां प्रमाणं विवो इत्यत्र नास्ति अतः अयं अनुमानं कर्तुं सुलभं यत् अकार्यकारी पीएनः स्वयमेव धमनीकाठिन्यम् वर्धयित्वा आत्मसातप्रक्रियायाः चालितस्य टीसीए-मध्यवर्तीनां सेवनस्य क्षतिपूर्तिं कर्तुं शक्नुवन्ति विशेषतः, एस्पार्टिक अम्लस्य वर्धितां माङ्गं निर्वाहयितुम् PCx इत्यस्य अपरेग्यूलेशनस्य आवश्यकता भवितुम् अर्हति, यत् माइटोकॉन्ड्रिया-विकारयुक्तेषु प्रसारितकोशिकासु दर्शितम् अस्ति (45) तथापि, अस्माकं मेटाबोलोमिक्स विश्लेषणेन Mfn2cKO PNs (चित्र S6A) इत्यस्मिन् एस्पार्टिक अम्लस्य स्थिर-स्थितिस्तरस्य किमपि महत्त्वपूर्णं परिवर्तनं न प्रकाशितम्, यत् अनुमानतः प्रसारितकोशिकानां तथा पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्सयोः मध्ये एस्पार्टिक अम्लस्य भिन्नचयापचयस्य उपयोगं प्रतिबिम्बयति यद्यपि विवो-मध्ये अकार्यकर-न्यूरोन्-मध्ये PCx-उपनियमनस्य सटीक-तन्त्रस्य लक्षणं अवशिष्टम् अस्ति, तथापि अस्माभिः प्रदर्शितं यत् एषा अकालप्रतिक्रिया न्यूरॉन्सस्य रेडॉक्स-स्थितिं निर्वाहयितुम् महत्त्वपूर्णां भूमिकां निर्वहति, यत् सेरिबेलर-स्लाइस्-उपरि FLIM-प्रयोगेषु प्रदर्शितम् आसीत् विशेषतः, PNs PCx अप-रेगुलेटिङ्ग् कर्तुं निवारयितुं अधिकं आक्सीकृत अवस्थां जनयितुं कोशिकामृत्युः त्वरितुं च शक्नोति । बीसीएए-क्षयस्य सक्रियीकरणं पाइरुवेट्-कार्बोक्जिलेशनं च माइटोकॉन्ड्रिया-विकारस्य परिधीय-उपस्थानां लक्षणं ज्ञातुं उपायाः न सन्ति (7) अतः ते OXPHOS-अभावयुक्तानां न्यूरॉन्सानाम् प्राथमिकताविशेषता इति भासन्ते, यद्यपि एकमात्रं वैशिष्ट्यं न भवति, यत् न्यूरोडीजनरेशनस्य कृते महत्त्वपूर्णम् अस्ति .
मस्तिष्करोगः एकः विषमः प्रकारः न्यूरोडिजनरेटिव रोगः अस्ति यः प्रायः अटैक्सियारूपेण प्रकटितः भवति तथा च प्रायः पीएन्स् इत्यस्य क्षतिं करोति (46) । इयं न्यूरॉनजनसंख्या माइटोकॉन्ड्रियाविकारस्य विशेषतया दुर्बलः भवति यतोहि मूषकेषु तेषां चयनात्मकक्षयः मानवस्य स्पाइनोसेरिबेलर-अटैक्सिया-लक्षणानाम् अनेकानाम् मोटरलक्षणानाम् पुनरुत्पादनार्थं पर्याप्तः भवति (16, 47, 48) रिपोर्ट्-अनुसारं उत्परिवर्तित-जीन-युक्तः ट्रांसजेनिक-मूषक-प्रतिरूपः मानव-स्पाइनोसेरिबेलर-अटैक्सिया-सहितः अस्ति तथा च माइटोकॉन्ड्रिया-विकारः (49, 50) अस्ति, यत् PNPH-मध्ये OXPHOS-अभावस्य परिणामानां अध्ययनस्य महत्त्वं बोधयति अतः एतस्याः अद्वितीयस्य न्यूरॉनजनसंख्यायाः प्रभावीरूपेण पृथक्करणं अध्ययनं च विशेषतया उपयुक्तम् अस्ति । परन्तु पीएन-जनाः दबावस्य प्रति अतीव संवेदनशीलाः भवन्ति तथा च सम्पूर्णस्य मस्तिष्ककोशिकाजनसंख्यायाः न्यूनभागं गृह्णन्ति इति दृष्ट्वा, अनेकेषां ओमिक्स-आधारित-अध्ययनानाम् कृते, तेषां समग्रकोशिकारूपेण चयनात्मक-पृथक्करणम् अद्यापि एकः चुनौतीपूर्णः पक्षः अस्ति यद्यपि अन्यकोशिकाप्रकारस्य (विशेषतः वयस्क ऊतकानाम्) दूषणस्य निरपेक्षाभावं प्राप्तुं प्रायः असम्भवम्, तथापि वयं FACS इत्यनेन सह एकं प्रभावी विच्छेदनपदं संयोजितवन्तः यत् अधःप्रवाहस्य प्रोटीओमिक्सविश्लेषणार्थं पर्याप्तसङ्ख्यां व्यवहार्यन्यूरोन्स् प्राप्तुं शक्नुमः, तथा च सम्पूर्णस्य मस्तिष्कस्य विद्यमानस्य आँकडासमूहस्य तुलने अत्यन्तं उच्चं प्रोटीनकवरेजं (लगभग 3000 प्रोटीनानि) अस्ति (51)। सम्पूर्णकोशिकानां व्यवहार्यतां संरक्षित्वा अत्र वयं यत् पद्धतिं प्रदामः तत् न केवलं माइटोकॉन्ड्रियायां चयापचयमार्गेषु परिवर्तनस्य जाँचं कर्तुं शक्नोति, अपितु तस्य कोशिकाद्रव्यसमकक्षेषु परिवर्तनस्य जाँचं कर्तुं शक्नोति, यत् कोशिकाप्रकारविशिष्टस्य माइटोकॉन्ड्रिया-झिल्ली-लेबल-समृद्धेः उपयोगस्य पूरकं भवति जटिल-उतकेषु माइटोकॉन्ड्रिया-सङ्ख्यायाः कृते नूतना पद्धतिः (५२, ५३) वयं यत् पद्धतिं वर्णयामः तत् न केवलं पुर्किन्जे कोशिकानां अध्ययनेन सह सम्बद्धा अस्ति, अपितु रोगग्रस्तमस्तिष्केषु चयापचयपरिवर्तनानां सम्बोधनाय कस्यापि प्रकारस्य कोशिकायां सहजतया प्रयोक्तुं शक्यते, यत्र माइटोकॉन्ड्रियाविकारस्य अन्यमाडलाः अपि सन्ति
अन्ते अस्माभिः अस्मिन् चयापचयपुनर्व्यवस्थापनप्रक्रियायाः कालखण्डे एकं चिकित्साविण्डो चिह्नितं यत् कोशिकीयतनावस्य प्रमुखलक्षणं पूर्णतया विपर्ययितुं न्यूरॉनलक्षयस्य निवारणं कर्तुं शक्नोति। अतः अत्र वर्णितस्य तारीकरणस्य कार्यात्मकनिमित्तानां अवगमनेन माइटोकॉन्ड्रियाविकारस्य समये न्यूरॉनल व्यवहार्यतां निर्वाहयितुम् सम्भाव्यचिकित्सानां मौलिकदृष्टिः प्राप्यते अन्येषु मस्तिष्ककोशिकाप्रकारेषु ऊर्जाचयापचयस्य परिवर्तनस्य विच्छेदनं लक्ष्यं कृत्वा भविष्यस्य शोधस्य आवश्यकता वर्तते यत् अन्येषु तंत्रिकारोगेषु अस्य सिद्धान्तस्य प्रयोज्यता पूर्णतया प्रकाशयितुं शक्यते
MitoPark मूषकाणां वर्णनं पूर्वं कृतम् अस्ति (31) । loxP flanking Mfn2 जीनयुक्ताः C57BL/6N मूषकाः पूर्वं वर्णिताः सन्ति (18) तथा च L7-Cre मूषकैः सह संकरिताः (23) । ततः परिणामस्वरूपं द्विगुणं विषमसंयुग्मसंतानं समसंयुग्म Mfn2loxP/Mfn2loxP मूषकैः सह पारं कृत्वा Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) कृते पुर्किन्जे-विशिष्टजीन-नॉकआउट् उत्पन्नं कृतम् संभोगस्य उपसमूहे अतिरिक्तसंकरस्य (20) माध्यमेन Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP एलील (stop-mtYFP) परिचयः कृतः । सर्वाणि पशुप्रक्रियाणि यूरोपीय, राष्ट्रिय, संस्थागतमार्गदर्शिकानुसारं कृताः तथा च जर्मनीदेशस्य उत्तरराइन-वेस्टफेलियादेशस्य उम्वेल्ट् तथा वर्ब्राउचर्स्चुट्ज् इत्यस्य LandesamtfürNatur इत्यनेन अनुमोदिताः। पशुकार्यं यूरोपीयप्रयोगशालापशुविज्ञानसङ्घस्य मार्गदर्शनस्य अनुसरणं अपि भवति ।
गर्भिणीयाः गर्भाशयस्य विक्षेपं संज्ञाहरणं कृत्वा मूषकस्य भ्रूणस्य पृथक्करणं भवति (E13) । प्रांतस्थायाः विच्छेदनं कृत्वा 10 mM Hepes इत्यनेन पूरितेन Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) इत्यस्मिन् विच्छेदनं कृत्वा Dulbecco इत्यस्य Modified Eagle’s Medium इत्यत्र पपेन (20 U/ml) तथा सिस्टीन (1μg/ml) युक्ते पारितं कृतम् ऊतकं DMEM) मध्ये इन्क्यूबेट् कृत्वा एन्जाइमिक पाचनेन विच्छेदयन्तु । Ml) 37°C मध्ये 20 मिनिट् यावत्, ततः 10% भ्रूणगोजातीयसीरमेन पूरिते DMEM इत्यस्मिन् यांत्रिकरूपेण पिष्टं कृतम्। कोशिकानां बीजं प्रति ६ सेमी संवर्धनपात्रे २×१०६ घनत्वे अथवा ०.५×१०५ कोशिका/सेमी२ घनत्वे पॉलीलाइसिनेन लेपितेषु काचस्य आवरणस्लिप् इत्यत्र इमेजिंग विश्लेषणार्थं बीजं कृतम् ४ घण्टानां अनन्तरं माध्यमस्य स्थाने १% B27 पूरकं 0.5 mM GlutaMax च युक्तं Neurobasal सीरम-रहितं माध्यमं स्थापितं । ततः न्यूरॉन्-इत्येतत् सम्पूर्णे प्रयोगे ३७°C तथा ५% CO2 इत्यत्र स्थापितं, सप्ताहे एकवारं भोजनं च दत्तम् । इन विट्रो इत्यत्र पुनर्संयोजनं प्रेरयितुं द्वितीयदिने इन विट्रो इत्यत्र न्यूरॉन्सस्य उपचारार्थं निम्नलिखित AAV9 वायरस वेक्टरस्य 3μl (24-वेल कल्चर डिश) अथवा 0.5μl (24-वेल प्लेट) इत्यस्य उपयोगः कृतः: AAV9.CMV.PI.eGFP WPRE.bGH (Addgene, कैटलॉग नम्बर 105530-AAV9) तथा AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, कैटलॉग नम्बर 105545-AAV9) च ।
माउस Mfn1 तथा Mfn2 पूरक DNA (क्रमशः Addgene प्लाज्मिड् #23212 तथा #23213 तः प्राप्तम्) C-अन्तस्थाने V5 अनुक्रमेण (GKPIPNPLLGLDST) सह चिह्नितं भवति, तथा च T2A अनुक्रमस्य माध्यमेन mCherry इत्यनेन फ्रेममध्ये संलयनं भवति Grx1-roGFP2 हाइडेल्बर्ग् टीपी डिक् डीएफकेजेड् (Deutsches Krebsforschungszentrum) इत्यस्य उपहारः अस्ति । पारम्परिक क्लोनिंग पद्धतीनां उपयोगेन tdTomato कैसेट् प्रतिस्थापयित्वा, कैसेट् pAAV-CAG-FLEX-tdTomato मेरुदण्डे (Addgene सन्दर्भसङ्ख्या 28306) उपक्लोन् कृत्वा pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 तथा... pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 सदिश। नियन्त्रणसदिश pAAV-CAG-FLEX-mCherry इत्यस्य निर्माणार्थं एतादृशी एव रणनीतिः प्रयुक्ता । AAV-shPCx निर्माणं जनयितुं प्लाज्मिड् AAV वेक्टर (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) आवश्यकं भवति, यस्मिन् shRNA लक्ष्यं कृत्वा माउस PCx (5′CTTTCGCTCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCCTACCTTAGAGCGAAAG) इत्यस्य डीएनए अनुक्रमः भवति ३′) U6 प्रवर्तकस्य नियन्त्रणे mCherry इत्यस्य उपयोगः CMV प्रवर्तकस्य नियन्त्रणे भवति । सहायक एएवी वेक्टर् इत्यस्य उत्पादनं निर्मातुः निर्देशानुसारं (Cell Biolabs) कृतम् । संक्षेपेण, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) क्षणिकरूपेण 293AAV कोशिकानां-T2A-MFN1-V5), mCherry इत्यस्य संक्रमणं वहन् स्थानान्तरणप्लाज्मिडस्य उपयोगं कुर्वन्तु (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) अथवा Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिंग जीन, तथा च AAV1 कैप्सिड प्रोटीन कोडिंग तथा सहायक प्रोटीन पैकेजिंग प्लाज्मिड प्लाज्मिड्, कैल्शियम फॉस्फेट पद्धतेः उपयोगेन। कच्चा वायरसस्य सुपरनेटेंटं शुष्कहिम/इथेनॉलस्नाने फ्रीज-थॉ चक्रद्वारा तथा फॉस्फेट बफरयुक्ते खारा (PBS) इत्यस्मिन् लाइज्ड् कोशिकाभिः प्राप्तम् एएवी वेक्टरं असंतत आयोडिक्सानॉल ढाल अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूजेशनेन (32,000 आरपीएम तथा 4 डिग्री सेल्सियस इत्यत्र 24 घण्टाः) शुद्धं कृत्वा एमिकोन अल्ट्रा-15 अपकेन्द्रापसारक-छिद्रकस्य उपयोगेन सान्द्रीकृतम् AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 जीनोम प्रतिलिपि (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX इत्यस्य जीनोम टीटर पूर्व वर्णितरूपेण (54) आसीत्, वास्तविकसमय मात्रात्मक PCR (qPCR) द्वारा मापा -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) तथा AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml)।
प्राथमिक न्यूरॉन्सं हिमशीत 1x PBS इत्यस्मिन् स्क्रैप् कृत्वा गोलियां कृत्वा ततः 0.5% ट्राइटन एक्स-100 / 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोलेट्/PBS लाइसिस बफर इत्यस्मिन् फॉस्फेटेज तथा प्रोटीज इन्हिबिटर (Roche) युक्ते समरूपीकरणं कृतम् बाइसिन्कोनिनिक अम्लपरीक्षणस्य (Thermo Fisher Scientific) उपयोगेन प्रोटीनस्य परिमाणीकरणं कृतम् । ततः प्रोटीनानि SDS-polyacrylamide gel electrophoresis द्वारा पृथक् कृताः, ततः polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare) इत्यत्र ब्लोट् कृताः अविशिष्टस्थलानि अवरुद्ध्य प्राथमिकप्रतिपिण्डेन सह (विवरणार्थं सारणी S1 पश्यन्तु) TBST (Tris-buffered saline with Tween) इत्यस्मिन् 5% दुग्धे, TBST Incubate इत्यस्मिन् प्रक्षालनस्य चरणेषु तथा च द्वितीयकप्रतिपिण्डेन सह इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु। प्राथमिकप्रतिपिण्डेन सह +४°C मध्ये रात्रौ यावत् इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु। प्रक्षालनानन्तरं द्वितीयकप्रतिपिण्डं २ घण्टापर्यन्तं कक्षतापमाने प्रयोजयन्तु । तदनन्तरं एण्टी-β-एक्टिन् प्रतिपिण्डेन सह समानं ब्लोट् इन्क्यूबेशनं कृत्वा समानं भारस्य पुष्टिः अभवत् । रसायनप्रकाशं प्रति परिवर्तनं कृत्वा रसायनप्रकाशं वर्धयित्वा (GE Healthcare) अन्वेषणम् ।
पूर्वं काचस्य आवरणस्लिप् इत्यत्र बीजयुक्तानि न्यूरॉन् 4% पैराफॉर्मल्डीहाइड् (PFA)/PBS इत्यनेन निर्दिष्टसमयबिन्दौ कक्षतापमाने 10 निमेषपर्यन्तं निश्चयितानि आसन्। कवरस्लिप्स् प्रथमं ०.१% ट्राइटन् एक्स-१००/पीबीएस इत्यनेन ५ निमेषपर्यन्तं कक्षतापमाने, ततः अवरोधकबफरे [३% गोजातीयसीरम एल्बुमिन (BSA)/PBS] इत्यत्र व्याप्ताः भवन्ति द्वितीयदिने कवरस्लिप्स् अवरोधकबफरेन प्रक्षाल्य उपयुक्तेन फ्लोरोफोर-संयुग्मितद्वितीयकप्रतिपिण्डेन सह कक्षतापमाने २ घण्टापर्यन्तं इन्क्यूबेशनं कृतम् अन्ततः, नमूनानि 4′,6-डायमिडिनो-2 -फेनिलिण्डोल् (DAPI) इत्यनेन सह PBS इत्यस्मिन् सम्यक् प्रक्षालितानि आसन् ततः प्रतिरङ्गः भवति ततः एक्वा-पोली/माउण्ट् इत्यनेन सूक्ष्मदर्शीस्लाइड् इत्यत्र निश्चयः कृतः।
मूषकान् (पुरुषान् मादाश्च) केटामाइन् (130 mg/kg) तथा xylazine (10 mg/kg) इत्यस्य intraperitoneal injection द्वारा बेहोशं कृत्वा carprofen analgesic (5 mg/kg) इत्यनेन चर्मस्य अधः प्रशासितम् , तथा च उष्णपैड इत्यनेन सुसज्जिते stereotactic यन्त्रे (Kopf) स्थापितं। कपालं उजागरयन्तु तथा च दन्त-अभ्यासस्य उपयोगेन मिस् अस्थि-अनुरूपं मस्तिष्ककोशिकस्य भागं पतलं कुर्वन्तु (लैम्ब्डातः: पुच्छं १.८, पार्श्व-१, चतुर्थ-पञ्चम-लोबुलयोः अनुरूपम्) वक्रसिरिन्जसुईयाः उपयोगेन कपालस्य लघुच्छिद्रं सावधानीपूर्वकं निर्मायताम् येन अधः नाडीविज्ञानस्य बाधा न भवति । ततः पतली आकृष्टा काचकेशिका सूक्ष्मछिद्रे (दुरा मेटरस्य उदरपक्षे -१.३ तः -१ पर्यन्तं) शनैः शनैः प्रविष्टा भवति, तथा च १० तः २० निमेषपर्यन्तं खिडकीपर्यन्तं न्यूनदाबेन हस्तसिरिन्जैः (नरिशिगे) सूक्ष्म-इञ्जेक्टरे (नरिशिगे) २०० तः ३०० एनएल एएवी-इत्येतत् अनेकवारं इन्जेक्शनं भवति इन्फ्यूजनस्य अनन्तरं केशिकाम् अपि १० निमेषान् यावत् स्थापयन्तु येन विषाणुः सम्पूर्णतया प्रसरति । केशिकानां निवृत्तेः अनन्तरं त्वक् सावधानीपूर्वकं सिवनी भवति यत् व्रणस्य शोथः न्यूनीकरोति, पशुः पुनः स्वस्थः भवति । पशूनां शल्यक्रियायाः अनन्तरं कतिपयान् दिनानि यावत् वेदनाशामकदवैः (कास्पोफेन्) उपचारः कृतः, तस्मिन् काले तेषां शारीरिकस्थितिः सावधानीपूर्वकं निरीक्षिता, ततः उक्तसमये तेषां मृत्यौ करणं कृतम् सर्वाणि प्रक्रियाणि यूरोपीय-राष्ट्रीय-संस्थागत-मार्गदर्शिकानां अनुसारं कृताः, जर्मनी-देशस्य उत्तर-राइन-वेस्टफेलिया-नगरस्य उम्वेल्ट्-वर्ब्राउचर्स्चुट्ज्-इत्यस्य च LandesamtfürNatur-इत्यनेन अनुमोदिताः
पशूनां केटामाइन् (१०० मिग्रा/किलोग्राम) तथा ज़ाइलाजिन (१० मिग्रा/किलोग्राम) इत्यनेन संज्ञाहरणं कृतम्, ततः प्रथमं ०.१ एम पीबीएस इत्यनेन, ततः पीबीएस इत्यस्मिन् ४% पीएफए ​​इत्यनेन हृदयं परफ्यूज् कृतम् ऊतकस्य विच्छेदनं कृत्वा ४% PFA/PBS इत्यस्मिन् ४°C मध्ये रात्रौ यावत् स्थिरं कृतम् । पीबीएस-मध्ये नियतमस्तिष्कात् धनुषः खण्डान् (५० माइक्रोमीटर् मोटाई) निर्मातुं स्पन्दन-छुरी (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) इत्यस्य उपयोगः कृतः । अन्यथा निर्दिष्टं न भवति चेत्, मुक्तप्लवकखण्डानां दागः यथा उपरि वर्णितं (13) कक्षतापमाने, हलचलं च कृतम् संक्षेपेण प्रथमं प्राप्तानि स्लाइस् 0.5% Triton X-100/PBS इत्यनेन कक्षतापमाने 15 निमेषपर्यन्तं पारगम्यीकरणं कृतम्; केषाञ्चन एपिटोप्स् (Pcx तथा Shmt2) कृते, by in tris-EDTA buffer at 80°C (PH 9) अस्य चरणस्य स्थाने 25 निमेषपर्यन्तं स्लाइस् तापयन्तु। तदनन्तरं, खण्डान् प्राथमिकप्रतिपिण्डेन (द्रष्टव्यम् - सारणी S1) सह अवरोधकबफर (3% BSA/PBS) मध्ये 4°C मध्ये रात्रौ यावत् हलचलं कृत्वा इन्क्यूबेशनं कृतम् परदिने, खण्डान् अवरोधकबफरेन प्रक्षाल्य उपयुक्तेन फ्लोरोफोर-संयुग्मितद्वितीयकप्रतिपिण्डेन सह कक्षतापमाने २ घण्टापर्यन्तं इन्क्यूबेट् कृतम् अन्ते, खण्डाः PBS इत्यस्मिन् सम्यक् प्रक्षालिताः, DAPI इत्यनेन प्रति-रञ्जिताः, ततः AquaPolymount On a microscope slide इत्यनेन स्थिराः कृताः ।
नमूनायाः प्रतिबिम्बं कर्तुं श्वेतप्रकाशलेजरेन, ४०५ डायोड पराबैंगनीलेजरेन च सुसज्जितस्य लेजर-स्कैनिङ्ग-सङ्केत-सूक्ष्मदर्शकस्य (TCS SP8-X अथवा TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) उपयोगः कृतः फ्लोरोफोरस्य उत्तेजनं कृत्वा Hybrid Detector (HyDs) इत्यनेन संकेतं संग्रह्य LAS-X सॉफ्टवेयरस्य उपयोगः क्रमिकमोडमध्ये Nyquist नमूनाकरणस्य अनुरूपं स्तम्भितप्रतिमानां संग्रहणार्थं कृतः: गैर-मात्रागतपैनलस्य कृते, एतत् अत्यन्तं गतिशीलसंकेतानि (उदाहरणार्थं, दैहिककोशिकासु तथा डेण्ड्राइट्-मध्ये) mtYFP) BrightR मोड्-मध्ये PN-सङ्ख्यां ज्ञातुं HyD-इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु पृष्ठभूमिं न्यूनीकर्तुं ०.३ तः ६ ns पर्यन्तं गेटिंग् प्रयुक्तं भवति ।
क्रमबद्धकोशिकानां वास्तविकसमयप्रतिबिम्बनम्। 1% B27 पूरकं 0.5 mM GlutaMax च युक्ते Neurobasal-A माध्यमे क्रमणस्य अनन्तरं कोशिकानां तत्क्षणमेव poly-l-lysine-लेपितकाचस्लाइड् (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826) इत्यत्र बीजं कृतम् , ततः कोशिकानां निवेशनं कर्तुं 37°C तथा 5% CO2 इत्यत्र 1 घण्टापर्यन्तं स्थापितं। श्वेतलेजर, HyD, 63×[1.4 संख्यात्मक एपर्चर (NA)] तैलस्य उद्देश्यलेन्सेन, तापनमञ्चेन च सुसज्जिते Leica SP8 लेजर स्कैनिङ्ग कन्फोकल सूक्ष्मदर्शके वास्तविकसमयप्रतिबिम्बनं कृतम्
मूषकं शीघ्रं कार्बनडाय-आक्साइडेन संज्ञाहरणं कृत्वा शिरच्छेदनं कृतम्, मस्तिष्कं शीघ्रमेव कपालात् निष्कासितम्, तथा च 200μm मोटी (13C लेबलिंग प्रयोगस्य कृते) अथवा 275μm मोटी (द्वयोः फोटॉन प्रयोगयोः कृते) धनुषः खण्डे काटितः यत् निम्नलिखितसामग्रीभिः पूरितः आइसक्रीम (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) निम्नलिखितपदार्थैः पूरितः भवति : 125 mM हिमशीत, कार्बन-संतृप्त (95% O2 तथा 5% CO2) न्यून Ca2 + कृत्रिम मस्तिष्कमेरुद्रव (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25 mM NaHCO3, 25 mM ग्लूकोज, 0.5 mM CaCl2 तथा ३.५ mM MgCl2 (३१० तः ३३० mmol यावत् आसमाटिकदाबः) । प्राप्तमस्तिष्कस्लाइस् अधिकं Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 तथा 2.0 mM MgCl2) युक्ते पूर्व-उष्मायन-कक्षे स्थानान्तरयन्तु। मध्यम) पीएच ७.४ तथा ३१० तः ३२० मिलीमोल)।
इमेजिंग् प्रक्रियायाः कालखण्डे स्लाइस् समर्पिते इमेजिंग-कक्षे स्थापिताः, प्रयोगः च ३२° तः ३३°C पर्यन्तं नित्यतापमानस्य निरन्तर-ACSF-परफ्यूजनस्य अन्तर्गतं कृतः स्लाइस् इमेजिंग् कृते लीका २५x उद्देश्यलेन्स (NA 0.95, जल) इत्यनेन सुसज्जितस्य बहुफोटोन लेजर स्कैनिङ्ग माइक्रोस्कोपस्य (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) उपयोगः कृतः, Ti: Sapphire लेजर (Chameleon Vision II, Coherent) इति FLIM मॉड्यूल (PicoHarp300, PicoQuant)।
Grx1-roGFP2 के FLIM। पीएन-समूहस्य कोशिकाद्रव्य-रेडॉक्स-स्थितौ परिवर्तनं धनुषी-मस्तिष्क-स्लाइस्-मध्ये द्वि-फोटॉन-FLIM-द्वारा मापितं, यत्र Grx1-roGFP2-बायोसेन्सर्-इत्यनेन पीएन-इत्येतत् लक्ष्यं कृतम् पीएन-स्तरस्य, अधिग्रहणक्षेत्रस्य चयनं स्लाइस्-पृष्ठस्य अधः प्रायः 50 तः 80 μm यावत् भवति यत् सुनिश्चितं भवति यत् व्यवहार्यः पीएन (अर्थात् डेण्ड्राइट्-सङ्गमे मणि-संरचनायाः अभावः अथवा न्यूरॉनल-आकृति-परिवर्तनानां अभावः) तथा च द्विगुण-सकारात्मक-roGFP2-संवेदकः तथा च एएवी-एन्कोडिंग् shRNA PCx अथवा तस्य नियन्त्रण-अनुक्रमः (प्रत्येकः mCherry-सह-अभिव्यक्तः) अस्ति 2x डिजिटल जूम [उत्तेजना तरङ्गदैर्घ्यम्: 890 एनएम; ५१२ एनएम ५१२ पिक्सेल्] । अन्वेषणम् : आन्तरिक HyD, फ्लोरोसेन आइसोथियोसाइनेट् (FITC) फ़िल्टर समूह] तथा च 2 तः 3 मिनिट् यावत् चित्रस्य औसतीकरणस्य उपयोगः भवति यत् एतत् सुनिश्चितं करोति यत् वक्र-फिटिंग् कृते पर्याप्तं फोटॉन् एकत्रितं भवति (कुलं 1000 फोटॉन्) Grx1-roGFP2 अन्वेषणस्य संवेदनशीलता तथा FLIM-स्थितीनां सत्यापनम् roGFP2 इत्यस्य आयुषः मूल्यस्य निरीक्षणेन कृतम् यदा परफ्यूजन ACSF मध्ये बहिर्जातीय 10 mM H2O2 योजयित्वा (आक्सीकरणं अधिकतमं कर्तुं, यस्य परिणामेण आयुः वर्धते), ततः 2 mM dithiothreitol योजयित्वा (कमीकरणस्य डिग्री न्यूनीकरोति, यस्य परिणामेण न्यूनता भवति आयुषः) (चित्रम् S8, D तः G पर्यन्तम्)। अधिग्रहीतपरिणामानां विश्लेषणार्थं FLIMfit 5.1.1 सॉफ्टवेयरस्य उपयोगं कुर्वन्तु, सम्पूर्णस्य चित्रस्य एकघटिकक्षयवक्रं मापिते IRF (यन्त्रप्रतिसादकार्य) मध्ये फिट् कुर्वन्तु, तथा च χ2 प्रायः 1. एकस्य PN इत्यस्य आयुःकालस्य गणनाय, तंत्रिकाशरीरस्य परितः मुखौटं हस्तचलितरूपेण आकृष्यते स्म, तथा च प्रत्येकस्मिन् मास्कस्य औसतजीवनकालस्य उपयोगः परिमाणनिर्धारणाय कृतः
माइटोकॉन्ड्रिया विभव विश्लेषण। तीव्रखण्डं 30 निमेषपर्यन्तं प्रत्यक्षतया परफ्यूज्ड् ACSF मध्ये योजितेन 100 nM TMRM इत्यनेन सह इन्क्यूबेशनस्य अनन्तरं PNs इत्यस्य माइटोकॉन्ड्रियाविभवपरिवर्तनं द्वि-फोटॉनसूक्ष्मदर्शकेन मापितं TMRM इमेजिंग् ९२० एनएम इत्यत्र अन्वेषणं उत्तेजयित्वा संकेतानां संग्रहणार्थं आन्तरिक HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) इत्यस्य उपयोगेन कृतम्; समान उत्तेजना तरङ्गदैर्घ्यस्य उपयोगेन परन्तु mtYFP इत्यस्य प्रतिबिम्बं कर्तुं भिन्नस्य आन्तरिकस्य HyD (FITC :525/50) इत्यस्य उपयोगेन । एककोशिकस्तरस्य माइटोकॉन्ड्रियाक्षमतायाः मूल्याङ्कनार्थं ImageJ इत्यस्य Image Calculator प्लग-इनस्य उपयोगं कुर्वन्तु । संक्षेपेण, प्लग-इन् समीकरणम्: signal = min (mtYFP, TMRM) इत्यस्य उपयोगः माइटोकॉन्ड्रियाक्षेत्रस्य पहिचानाय भवति यत् तत्सम्बद्धस्य चैनलस्य एकल-ढेर-सङ्केत-प्रतिबिम्बे पुर्किन्जे सोमाली-भाषायां TMRM-संकेतं दर्शयति ततः परिणामी मास्कस्य पिक्सेलक्षेत्रस्य परिमाणं भवति, ततः mtYFP चैनलस्य तत्सम्बद्धे दहलीज-एक-स्टैक-प्रतिबिम्बे सामान्यीकृत्य माइटोकॉन्ड्रिया-विभवं दर्शयन् माइटोकॉन्ड्रिया-अंशं प्राप्तुं शक्यते
Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) इति सॉफ्टवेयर् इत्यनेन इमेज् डिकन्वोल्यूट् कृतम् । टाइल्स् इत्यस्य स्कैन् कृतानां चित्राणां कृते एकस्य टाइल् इत्यस्य मोण्टेज् LAS-X सॉफ्टवेयर इत्यनेन प्रदत्तस्य स्वचालितस्य सिलाई एल्गोरिदम् इत्यस्य उपयोगेन क्रियते । चित्रमापनस्य अनन्तरं चित्रं अधिकं संसाधितुं तथा च प्रकाशं विपरीततां च एकरूपेण समायोजयितुं ImageJ तथा Adobe Photoshop इत्येतयोः उपयोगं कुर्वन्तु । चित्रनिर्माणार्थं Adobe Illustrator इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु ।
mtDNA फोकस विश्लेषण। confocal microscope द्वारा DNA विरुद्धं प्रतिपिण्डैः लेबलयुक्तेषु मस्तिष्ककोशिकाखण्डेषु mtDNA क्षतस्य संख्यायाः परिमाणं निर्धारितम् । प्रत्येकं लक्ष्यक्षेत्रं कोशिकाशरीरस्य प्रत्येकस्य कोशिकायाः ​​नाभिकस्य च कृते निर्मितम्, तथा च Multi Measure plug-in (ImageJ software) इत्यस्य उपयोगेन तत्तत्क्षेत्रस्य गणना कृता कोशिकाशरीरक्षेत्रात् नाभिकक्षेत्रं घटयित्वा कोशिकाद्रव्यक्षेत्रं प्राप्नुवन्तु । अन्ते, दहलीज-प्रतिबिम्बे mtDNA सूचयन्तः कोशिकाद्रव्य-डीएनए-बिन्दून् स्वयमेव परिमाणं कर्तुं Analyze Particles प्लग-इन् (ImageJ सॉफ्टवेयर) इत्यस्य उपयोगः कृतः, तथा च प्राप्ताः परिणामाः CTRL-मूषकाणां PN औसतं प्रति सामान्यीकृताः परिणामाः प्रतिकोशिका न्यूक्लिओसाइड्-सङ्ख्यायाः औसतसङ्ख्यारूपेण व्यक्ताः भवन्ति ।
प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। एककोशिकस्तरस्य PN मध्ये प्रोटीनव्यञ्जनस्य मूल्याङ्कनार्थं ImageJ इत्यस्य Image Calculator प्लग-इन् इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । संक्षेपेण, तत्सम्बद्धस्य चैनलस्य एकस्तरस्य संकेन्द्रीयप्रतिबिम्बे, समीकरणस्य माध्यमेन: संकेतः = min (mtYFP, प्रतिपिण्डः), पुर्किनायां कस्यचित् प्रतिपिण्डस्य प्रति प्रतिरक्षाप्रतिक्रियाशीलतां दर्शयति इति माइटोकॉन्ड्रियाप्रदेशः चिह्नितः भवति ततः परिणामी मास्कस्य पिक्सेलक्षेत्रस्य परिमाणं भवति, ततः प्रदर्शितस्य प्रोटीनस्य माइटोकॉन्ड्रिया-अंशं प्राप्तुं mtYFP-चैनलस्य तत्सम्बद्धे दहलीज-एक-स्टैक-प्रतिबिम्बे सामान्यीकरणं भवति
पुर्किन्जे कोशिका घनत्व विश्लेषण। इमेजजे इत्यस्य Cell Counter प्लग-इन् इत्यस्य उपयोगः पुर्किन्जे-कोशिकानां संख्यां गणितानां कोशिकाभिः कब्जितस्य मस्तिष्कस्य वलयस्य दीर्घतायाः विभाजनेन पुर्किन्जे-घनत्वस्य मूल्याङ्कनार्थं कृतः
नमूनानिर्माणं संग्रहणं च। नियन्त्रणसमूहस्य मस्तिष्कं तथा Mfn2cKO मूषकाणां मस्तिष्कं 0.1 M फॉस्फेटबफर (PB) इत्यस्मिन् 2% PFA/2.5% ग्लूटारएलडीहाइड् इत्यस्मिन् स्थिरं कृतम्, ततः सिलिएट् (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (मोटाई 50 तः 60 μm) इत्यस्य उपयोगेन कोरोनलखण्डाः निर्मिताः ततः 1% os tetraoxide इत्यस्मिन् PB बफरमध्ये स्थिरीकरणं कृतम् तथा च १.५% पोटेशियम फेरोसायनाइड् कक्षतापमाने १ घण्टां यावत् । खण्डाः आसुतजलेन त्रिवारं प्रक्षालिताः, ततः १% यूरेनिल एसिटेट् युक्तेन ७०% इथेनॉलेन २० निमेषान् यावत् कलङ्किताः । ततः खण्डान् ग्रेडेड्-मद्ये निर्जलीकरणं कृत्वा सिलिकॉन-लेपित-काच-स्लाइड्-मध्ये डुरकुपन् एसीएम (Araldite casting resin M) इपोक्सी-राल (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) इत्यस्मिन् एम्बेडेड् कृतम्, अन्ते च 60°C मध्ये 48 घण्टापर्यन्तं ओवन-मध्ये Polymerize कृतम् सेरिबेलर कॉर्टेक्स क्षेत्रस्य चयनं कृत्वा 50 एनएम अतिपतले खण्डाः लीका अल्ट्राकट् (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) इत्यत्र कटयित्वा पॉलीस्टायरीन-फिल्मेन लेपितस्य 2×1 mm ताम्रस्लिट् जालस्य उपरि उद्धृताः खण्डान् H2O मध्ये 4% यूरेनिल एसिटेट् इत्यस्य घोलेन 10 निमेषान् यावत् रञ्जितवन्तः, H2O इत्यनेन अनेकवारं प्रक्षालितवन्तः, ततः H2O इत्यस्मिन् रेनॉल्ड्स् सीसा साइट्रेट् इत्यनेन 10 निमेषान् यावत् प्रक्षालिताः, ततः H2O इत्यनेन अनेकवारं प्रक्षालिताः टीवीआईपीएस (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 डिजिटल कैमरा (TVIPS GmbH, Gauting, USA) इत्यस्य उपयोगेन संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शकेन Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) इत्यनेन सूक्ष्मचित्रं गृहीतम् जर्मनी)।
एएवी-संक्रमितमूषकाणां कृते मस्तिष्कं पृथक् कृत्वा १ मि.मी.मोटे धनुषीखण्डे स्लाइस् कृत्वा, एएवी-संक्रमित-वलयस्य (अर्थात् mCherry-अभिव्यक्ति) पहिचानाय प्रतिदीप्ति-सूक्ष्मदर्शकस्य उपयोगेन मस्तिष्कस्य परीक्षणं कृतम् केवलं तेषु प्रयोगेषु उपयुज्यन्ते येषु एएवी-इञ्जेक्शनस्य परिणामेण पुर्किन्जे-कोशिका-स्तरस्य (अर्थात् प्रायः सम्पूर्ण-स्तरस्य) न्यूनातिन्यूनं द्वयोः क्रमशः मस्तिष्क-वलययोः अत्यन्तं उच्च-संप्रेषण-दक्षता भवति एएवी-परिवर्तितपाशस्य सूक्ष्मविच्छेदनं कृत्वा रात्रौ उत्तरनिर्धारणाय (0.1 M कोकोएट् बफरमध्ये 4% पीएफए ​​तथा 2.5% ग्लूटारएलडीहाइड्) अग्रे संसाधितं कृतम् EPON एम्बेडिंग् कृते, स्थिर ऊतकं 0.1 M सोडियम कोकोएट् बफर (Applichem) इत्यनेन प्रक्षालितम्, तथा च 0.1 M सोडियम कोकोएट् बफर (Applichem) इत्यस्मिन् 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) इत्यनेन सह 4 घण्टां यावत् इन्क्यूबेट् कृतम्, ततः 2 घण्टां यावत् प्रक्षालितम्। 0.1 M कोकामाइड बफरेन 3 वारं पुनः कुर्वन्तु। तदनन्तरं इथेनॉलस्य आरोहणश्रृङ्खलायाः उपयोगेन प्रत्येकं इथेनॉलविलयनं ४ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं १५ निमेषपर्यन्तं इन्क्यूबेट् कृत्वा ऊतकस्य निर्जलीकरणं कृतम् । ऊतकं प्रोपाइलीन आक्साइड् मध्ये स्थानान्तरितं कृत्वा EPON (Sigma-Aldrich) इत्यस्मिन् 4°C इत्यत्र रात्रौ यावत् इन्क्यूबेट् कृतम् । ऊतकं ताजा EPON मध्ये कक्षतापमाने २ घण्टापर्यन्तं स्थापयन्तु, ततः ६२°C मध्ये ७२ घण्टापर्यन्तं एम्बेड् कुर्वन्तु । 70 nm अतिपतले खण्डान् कटयितुं अल्ट्रामाइक्रोटोम (Leica Microsystems, UC6) तथा हीरकछुरी (Diatome, Biel, Switzerland) इत्येतयोः उपयोगं कुर्वन्तु, तथा च 37°C इत्यत्र 1.5% यूरेनाइल एसीटेट् इत्यनेन 15 मिनिट् यावत् दागयन्तु, तथा च सीसा साइट्रेट् घोलेन 4 मिनिट् यावत् दागयन्तु। इलेक्ट्रॉनसूक्ष्मचित्रं Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) तथा DigitalMicrograph software (Gatan) इत्यनेन सुसज्जितस्य JEM-2100 Plus संचरण इलेक्ट्रॉनसूक्ष्मदर्शकस्य (JEOL) उपयोगेन गृहीतम् विश्लेषणार्थं ५०००× अथवा १०,०००× डिजिटल जूम इत्यनेन इलेक्ट्रॉनसूक्ष्मचित्रं प्राप्तम् ।
माइटोकॉन्ड्रिया का रूपात्मक विश्लेषण। सर्वेषां विश्लेषणानाम् कृते व्यक्तिगतमाइटोकॉन्ड्रियानां समोच्चयः ImageJ सॉफ्टवेयरस्य उपयोगेन डिजिटल इमेजेषु मैन्युअल् रूपेण रूपरेखाकृताः आसन् । भिन्न-भिन्न रूपात्मक-मापदण्डानां विश्लेषणं भवति । माइटोकॉन्ड्रियाघनत्वं प्रत्येकस्य कोशिकायाः ​​कुलमाइटोकॉन्ड्रियाक्षेत्रं कोशिकाद्रव्यक्षेत्रेण (कोशिकाक्षेत्रेण = कोशिकाक्षेत्रं-कोशिकानाभिकक्षेत्रं) × 100 इत्यनेन विभज्य प्राप्तप्रतिशतरूपेण व्यक्तं भवति माइटोकॉन्ड्रियायाः गोलत्वस्य गणना [4π∙(क्षेत्रफल/परिधिः 2) माइटोकॉन्ड्रियायाः इस्टा आकृतिविज्ञानस्य विश्लेषणं कृत्वा तेषां मुख्याकारानुसारं द्वयोः वर्गयोः (“नलीरूपी” तथा “फोडा”) विभक्तम् ।
ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संख्या तथा घनत्व विश्लेषण। डिजिटल इमेजे प्रत्येकस्य ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोमस्य समोच्चं मैन्युअल् रूपेण रूपरेखां कर्तुं ImageJ सॉफ्टवेयरस्य उपयोगं कुर्वन्तु। आटोफेगोसोम/लाइसोसोमक्षेत्रं प्रत्येकस्य कोशिकायाः ​​कुल-आटोफेगोसोम/लाइसोसोमसंरचनाक्षेत्रं कोशिकाद्रव्यक्षेत्रेण (कोशिकाद्रव्यक्षेत्रं=कोशिकाक्षेत्रं-नाभिकक्षेत्रं)×१०० विभाजयित्वा गणितस्य प्रतिशतरूपेण व्यक्तं भवति आटोफेगोसोम/लाइसोसोमस्य घनत्वस्य गणना प्रतिकोशिकायां आटोफेगोसोम/लाइसोसोमसंरचनानां संख्यायाः (कोशिकाप्लाज्मिकक्षेत्रस्य दृष्ट्या) (कोशिकाप्लाज्मिकक्षेत्रस्य = कोशिकाक्षेत्र-नाभिकीयक्षेत्रस्य) कुलसङ्ख्यायाः विभाजनेन क्रियते
तीव्रविच्छेदनस्य नमूनानिर्माणस्य च लेबलिंग्। येषु प्रयोगेषु ग्लूकोजलेबलिंगस्य आवश्यकता भवति, तेषां कृते तीव्रमस्तिष्कस्य स्लाइस् पूर्व-उष्मायनकक्षे स्थानान्तरयन्तु, यस्मिन् संतृप्तकार्बन (95% O2 तथा 5% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM) भवति d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl 2 तथा 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 तथा 310 तः 320 mOsm तक समायोजित), यस्मिन् ग्लूकोज 13 C 6- ग्लूकोज प्रतिस्थापन (Eurisotop, catalog number CLM-1396) भवति। येषु प्रयोगेषु पाइरुवेट् लेबलिंग् आवश्यकं भवति, तेषां कृते तीव्रमस्तिष्कस्य स्लाइस् उच्चतर Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 च स्थानान्तरयन्तु तथा च 2.0mM योजयन्तु MgCl2, pH 7.4 तथा 310 320mOsm यावत् समायोजयन्तु, तथा 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, catalog number CLM-1082) योजयन्तु । खण्डान् ३७ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं ९० निमेषान् यावत् इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु । प्रयोगस्य अन्ते ७५ mM अमोनियमकार्बोनेट् युक्तेन जलीयविलयनेन (pH ७.४) खण्डान् शीघ्रं प्रक्षालितम्, ततः ४०:४०:२० (v:v:v) एसीटोनिट्राइल (ACN): मेथानल्: जलेन समरूपीकरणं कृतम् खण्डान् हिमे ३० निमेषान् यावत् इन्क्यूबेशनं कृत्वा नमूनानि २१,००० ग्रामे ४ डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं १० निमेषान् यावत् अपकेन्द्रीकृत्य, स्पष्टं सुपरनेटेंटं स्पीडवैक् सान्द्रकक्षे शुष्कं कृतम् परिणामस्वरूपं शुष्कं चयापचयस्य गोलीं विश्लेषणपर्यन्तं -८०°C मध्ये संगृहीतम् आसीत् ।
13 C-लेबलित अमीनो अम्लस्य द्रव क्रोमैटोग्राफी-द्रव्यमानवर्णक्रममापनविश्लेषणम्। द्रव क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) विश्लेषणार्थं चयापचयस्य गोलीं LC-MS ग्रेडजलस्य (Honeywell) 75μl पुनः निलम्बितवती 21,000 g इत्यत्र 4°C इत्यत्र 5 निमेषपर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणस्य अनन्तरं 20 μl स्पष्टीकृतस्य सुपरनेटेन्टस्य उपयोगः अमीनो अम्लप्रवाहविश्लेषणार्थं कृतः, शेषस्य अर्कस्य तत्क्षणमेव आयनविश्लेषणार्थं उपयोगः कृतः (अधः पश्यन्तु) अमीनो अम्लविश्लेषणं पूर्वं वर्णितस्य बेन्जोइलक्लोराइडव्युत्पन्नीकरणप्रोटोकॉलस्य (55, 56) उपयोगेन कृतम् । प्रथमे चरणे 20μl मेटाबोलाइट् अर्कस्य 10μl 100 mM सोडियमकार्बोनेट् (Sigma-Aldrich) योजितम्, ततः LC ग्रेड ACN मध्ये 10μl 2% बेन्जोइल क्लोराइड् (Sigma-Aldrich) योजितम् नमूना संक्षेपेण भंवरं कृत्वा ततः २१,००० ग्रामे २० डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं ५ निमेषपर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणं कृतम् । स्वच्छं सुपरनेटेंटं शंक्वाकारकाचस्य सम्मिलितं (200 μl आयतन) सह 2 ml ऑटोसैम्पलर शीशीयां स्थानान्तरयन्तु। नमूनानां विश्लेषणं Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) उच्च-रिजोल्यूशन-सटीक-मास-स्पेक्ट्रोमीटर् (Thermo Fisher Scientific) इत्यनेन सह सम्बद्धस्य Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) इत्यस्य उपयोगेन कृतम् विश्लेषणार्थं व्युत्पन्ननमूनायाः 2μl भागं 1.8μm कणयुक्ते 100×1.0 mm उच्चशक्तियुक्ते सिलिका T3 स्तम्भे (Waters) इन्जेक्शनं कृतम् प्रवाहस्य गतिः १००μl/min भवति, बफरप्रणाल्यां बफर ए (जले १० mM अमोनियम फॉर्मेट् तथा ०.१५% फॉर्मिक अम्लम्) बफर बी (ACN) च भवति ढालः निम्नलिखितरूपेण अस्ति : 0%B 0 निमेषेषु; ०%ख । ० तः १५% B पर्यन्तं ० तः ०.१ निमेषेषु; ०.१ तः ०.५ निमेषेषु १५ तः १७% B; ख १७ तः ५५% यावत् ०.५ तः १४ निमेषेषु; ख ५५ तः ७०% यावत् १४ तः १४.५ निमेषेषु; १८ निमेषेषु १४.५ तः ७० तः १००% बी यावत्; १८ तः १९ निमेषेषु १००% बी; १९ तः १९.१ निमेषेषु १०० तः ०% B; १९.१ तः २८ निमेषपर्यन्तं ०% बी (५५, ५६) । QE-HF द्रव्यमानवर्णक्रममापकं सकारात्मक आयनीकरणविधाने कार्यं करोति यस्य द्रव्यमानपरिधिः m/z (द्रव्यमान/आभार अनुपातः) 50 तः 750 पर्यन्तं भवति ।प्रयुक्तः संकल्पः ६०,००० भवति, तथा च प्राप्तः लाभनियन्त्रण (AGC) आयनलक्ष्यः ३×१०६ भवति, अधिकतमः आयनसमयः १०० मिलीसेकेण्ड् भवति तापितः विद्युत्स्प्रे आयनीकरण (ESI) स्रोतः ३.५ केवी स्प्रे वोल्टेज, २५० डिग्री सेल्सियस इत्यस्य केशिकातापमानेन, ६० एयू (मनमानानि यूनिट्) म्यानवायुप्रवाहेन, २० एयू सहायकवायुप्रवाहेन च कार्यं करोति २५० डिग्री सेल्सियस। S लेन्सः 60 AU इति सेट् भवति ।
आयन क्रोमैटोग्राफी-13C लेबल कार्बनिक अम्लस्य MS विश्लेषण। शेष मेटाबोलाइट् अवक्षेपस्य (55μl) विश्लेषणं QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटर् (Thermo Fisher Scientific) इत्यनेन सह सम्बद्धस्य Dionex आयन क्रोमैटोग्राफी प्रणाली (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) इत्यस्य उपयोगेन कृतम् संक्षेपेण, 5μl मेटाबोलाइट् अर्कं HPLC (2 mm×250 mm, कण आकारः 4μm, Thermo Fisher Scientific) इत्यनेन सुसज्जिते Dionex IonPac AS11-HC स्तम्भे 1. )on इत्यस्य भरण-अनुपातेन पुश-इन् आंशिक-पाश-मोड्-मध्ये इन्जेक्शनं कृतम् Dionex IonPac AG11-HC गार्ड कॉलम (2 मिमी x 50 मिमी, 4μm, थर्मो फिशर वैज्ञानिक)। स्तम्भस्य तापमानं ३०°C भवति, स्वनमूनाकरणं च ६°C इति सेट् भवति । विआयनीकृतजलेन सह प्रदत्तस्य पोटेशियमहाइड्रोक्साइड्-कार्टुजस्य उपयोगं कृत्वा इल्युएण्ट्-जनरेटर्-माध्यमेन पोटेशियम-हाइड्रोक्साइड्-ढालं जनयन्तु । चयापचयद्रव्याणां पृथक्करणं 380μl/min प्रवाहदरेण, निम्नलिखितढालं प्रयोजयित्वा: 0 तः 3 मिनिट्, 10 mM KOH; ३ तः १२ निमेषपर्यन्तं, १० तः ५० mM KOH; १२ तः १९ निमेषपर्यन्तं, ५० तः १०० mM KOH; 19 to 21 minutes , 100 mM KOH; २१ तः २१.५ निमेषपर्यन्तं, १०० तः १० मि.मी. स्तम्भं १० mM KOH इत्यस्य अन्तर्गतं ८.५ निमेषपर्यन्तं पुनः संतुलितं कृतम् ।
इल्युटेड् चयापचयद्रव्याणि स्तम्भस्य अनन्तरं १५०μl/min आइसोप्रोपानोल् पूरकधारा सह संयोजिताः भवन्ति ततः ऋणात्मक आयनीकरणविधाने कार्यं कुर्वन्तं उच्च-संकल्प-द्रव्यमान-वर्णक्रममापकं प्रति निर्देशयन्ति एमएस ६०,००० रिजोल्यूशनेन m/z ५० तः ७५० पर्यन्तं द्रव्यमानपरिधिं निरीक्षते । AGC 1×106 इति सेट् भवति, अधिकतमं आयनसमयं 100 ms इति स्थापितं भवति । तापितः ईएसआई स्रोतः ३.५ केवी स्प्रे वोल्टेज् इत्यनेन संचालितः आसीत् । आयनस्रोतस्य अन्ये सेटिङ्ग्स् निम्नलिखितरूपेण सन्ति : केशिकातापमानं २७५°C; म्यान गैस प्रवाह, 60 AU; सहायकगैसप्रवाहः, ३००°C इत्यत्र २० AU, तथा च S लेन्सः ६० AU यावत् सेट् भवति ।
13C लेबलयुक्तचयापचयद्रव्याणां आँकडाविश्लेषणम्। समस्थानिक अनुपातस्य आँकडाविश्लेषणार्थं TraceFinder सॉफ्टवेयर (संस्करणं 4.2, Thermo Fisher Scientific) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । प्रत्येकस्य यौगिकस्य परिचयः विश्वसनीयेन सन्दर्भसमासेन सत्यापितः, स्वतन्त्रतया च विश्लेषितः । समस्थानिकसंवर्धनविश्लेषणं कर्तुं प्रत्येकस्य 13C समस्थानिकस्य (Mn) निष्कासितस्य आयनवर्णक्रमस्य (XIC) क्षेत्रफलं [M + H] + तः निष्कासितम्, यत्र n लक्ष्ययौगिकस्य कार्बनसङ्ख्या अस्ति, यस्य उपयोगः अमीनो अम्लानां विश्लेषणार्थं भवति अथवा [ MH] + इत्यस्य उपयोगः आयनविश्लेषणार्थं भवति XIC इत्यस्य द्रव्यमानसटीकता प्रतिलक्षं पञ्चभागात् न्यूना भवति, आरटी इत्यस्य सटीकता च ०.०५ निमेषाः भवन्ति । प्रत्येकस्य ज्ञातस्य समस्थानिकस्य तत्सम्बद्धस्य यौगिकस्य सर्वेषां समस्थानिकानां योगस्य अनुपातस्य गणनां कृत्वा समृद्धिविश्लेषणं क्रियते । एते अनुपाताः प्रत्येकस्य समस्थानिकस्य प्रतिशतमूल्यानि इति दत्ताः, परिणामाः च मोलरप्रतिशतसंवर्धनरूपेण (MPE) रूपेण व्यक्ताः भवन्ति, यथा पूर्वं वर्णितम् (42)
जमेन न्यूरॉन् गोलीं हिमशीते ८०% मेथनॉल (v/v) इत्यस्मिन् समरूपीकृत्य, भंवरं कृत्वा -२०°C इत्यत्र ३० निमेषपर्यन्तं इन्क्यूबेट् कृतम् । नमूना पुनः भंवरं कृत्वा +४°C मध्ये ३० निमेषान् यावत् क्षोभयन्तु। नमूना 21,000 g मध्ये 4°C मध्ये 5 निमेषान् यावत् अपकेन्द्रीकरणं कृतम्, ततः परिणामस्वरूपं सुपरनेटेंटं एकत्रितं कृत्वा अनन्तरं विश्लेषणार्थं 25°C मध्ये SpeedVac सान्द्रकस्य उपयोगेन शुष्कं कृतम् यथा उपरि वर्णितं, क्रमबद्धकोशिकानां अमीनो अम्लेषु LC-MS विश्लेषणं कृतम् । TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) इत्यस्य उपयोगेन प्रत्येकस्य यौगिकस्य एकसमस्थानिकद्रव्यमानस्य उपयोगेन आँकडाविश्लेषणं कृतम् । मेटाबोलाइट्-आँकडानां क्वाण्टाइल-सामान्यीकरणं preprocessCore सॉफ्टवेयर-सङ्कुलस्य (57) उपयोगेन कृतम् ।
स्लाइस तैयारी। मूषकस्य शीघ्रं कार्बनडाय-आक्साइड्-इत्यनेन संज्ञाहरणं कृत्वा शिरच्छेदनं कृतम्, मस्तिष्कं शीघ्रमेव कपालात् निष्कासितम्, हिम-पूरित-कम्पन-छुरी (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) इत्यनेन ३०० तः ३७५ μm यावत् धनुष-खण्डेषु काटितम् Cold carbon gasification (95% O2 and 5% CO2) Low Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 तथा 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 तथा 310 तः 330 mOsm समायोजित करें)। प्राप्तमस्तिष्कस्लाइस् उच्चतर Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 4.0 mM CaCl2 तथा mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 तथा ३१० तः ३२० mOsm) यावत् । २० तः ३० निमेषान् यावत् स्लाइस् संग्रहयन्तु येन रिकार्ड् करणात् पूर्वं पुनः स्थापयितुं शक्यन्ते ।
अभिलेखनम् । सर्वेषां रिकार्डिङ्ग्-कृते नियत-अभिलेख-कक्षेण, २०x जल-विसर्जन-उद्देश्य-लेन्सेन (Scientifica)-युक्तेन सूक्ष्मदर्शक-मञ्चस्य उपयोगः कृतः कथितपुर्किन्जे कोशिकानां पहिचानः (i) शरीरस्य आकारः, (ii) मस्तिष्कस्य शारीरिकस्थानं, (iii) प्रतिदीप्त mtYFP रिपोर्टरजीनस्य अभिव्यक्तिः च कृतः ५ तः ११ मेगोम्स् यावत् अग्रप्रतिरोधयुक्तं पैचपिपेट् बोरोसिलिकेटकाचकेशिका (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) तथा क्षैतिजपिपेट् Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA) इत्यनेन बहिः आकृष्यते सर्वाणि रिकार्डिङ्ग्स् ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany) इत्यनेन कृता, यस्य नियन्त्रणं Software Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) इत्यनेन कृतम् आसीत् प्रयोगः १२.५ किलोहर्ट्ज इत्यस्य नमूनादरेण अभिलेखितः । संकेतं क्रमशः १.३ तथा १० किलोहर्ट्ज इत्यस्य कटऑफ आवृत्तियुक्तयोः शॉर्ट-पास-बेसेल्-छिद्रकयोः सह फ़िल्टर भवति । झिल्लीयाः पिपेटस्य च समाई प्रवर्धकस्य उपयोगेन क्षतिपूर्तिपरिपथेन क्षतिपूर्तिः भवति । सर्वे प्रयोगाः Orca-Flash 4.0 कैमरे (Hamamatsu, Gerden, Germany) इत्यस्य नियन्त्रणे कृताः, यत् Hokawo software (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany) इत्यनेन नियन्त्रितम् आसीत्
नियमितं सम्पूर्णकोशिकाविन्यासः विश्लेषणं च। अभिलेखनात् तत्क्षणात् पूर्वं पिपेटं आन्तरिकविलयनेन पूरयन्तु यस्मिन् निम्नलिखितपदार्थाः सन्ति: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM पोटेशियमग्लूकोनेट्, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) तथा १०.० mM क्रिएटिनिन फॉस्फेट् pH 7.25 यावत् समायोजितम्, तथा च आसमाटिकदाबः 290 mOsm (सुक्रोज) आसीत् । झिल्लीं भङ्गयितुं ० pA बलं प्रयोक्तव्यं तत्क्षणमेव विश्रामस्थलझिल्लीविभवं मापितं । -४०, -३०, -२०, -१० pA इत्यादीनां अतिध्रुवीकृतधाराणां प्रयोगेन निवेशप्रतिरोधस्य मापनं भवति । वोल्टेजप्रतिक्रियायाः परिमाणं मापयन्तु तथा च इनपुट् प्रतिरोधस्य गणनां कर्तुं Ohm इत्यस्य नियमस्य उपयोगं कुर्वन्तु । स्वतःस्फूर्तक्रियाकलापं 5 निमेषपर्यन्तं वोल्टेजक्लैम्पमध्ये अभिलेखितं, अर्धस्वचालितपरिचयलिप्याः उपयोगेन Igor Pro (संस्करणं 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) इत्यस्मिन् sPSC इत्यस्य पहिचानं मापनं च कृतम् IV वक्रं स्थिर-स्थिति-धारा च बैटरी-विभवयोः (-110 mV तः आरभ्य) क्लैम्पं कृत्वा 5 mV चरणेषु वोल्टेजं वर्धयित्वा माप्यते एपी इत्यस्य उत्पादनस्य परीक्षणं विध्रुवीकरणधाराप्रयोगेन कृतम् । विध्रुवीकरणधारा नाडीं प्रयोजयन् -70 mV इत्यत्र कोशिकां क्लैम्पं कुर्वन्तु। प्रत्येकस्य अभिलेखन-एककस्य चरण-आकारं पृथक् पृथक् (10 तः 60 pA) समायोजयन्तु । उच्चतम एपी आवृत्तिं जनयन्तः पल्स स्पाइक्स् मैन्युअल् रूपेण गणयित्वा अधिकतमं एपी आवृत्तिं गणयन्तु । एपी-दहलीजस्य विश्लेषणं विध्रुवीकरणनाडीयाः द्वितीयव्युत्पन्नस्य उपयोगेन भवति यत् प्रथमं एकं वा अधिकं एपीं प्रेरयति ।
छिद्रयुक्तं पैचविन्यासं विश्लेषणं च। मानकप्रोटोकॉलस्य उपयोगेन छिद्रयुक्तं पैच् रिकार्डिङ्ग् कुर्वन्तु । एटीपी- तथा जीटीपी-रहितस्य पिपेटस्य उपयोगं कुर्वन्तु यस्मिन् निम्नलिखितसामग्रीः न सन्ति: 128 mM ग्लूकोनेट् K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA तथा 2 mM MgCl2, तथा च pH 7.2 (KOH इत्यस्य उपयोगेन) समायोजयन्तु। कोशिकाझिल्लीयाः अनियंत्रितपारगम्यतां निवारयितुं अन्तःकोशिकीयविलयनात् एटीपी, जीटीपी च परित्यक्ताः भवन्ति । छिद्रयुक्तस्य पैचस्य अभिलेखं प्राप्तुं पैचपिपेट् एम्फोटेरिसिन् युक्तेन आन्तरिकविलयनेन (लगभग 200 तः 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) पूर्यते एम्फोटेरिसिन् डाइमिथाइल सल्फोक्साइड् (अन्तिमसान्द्रता: ०.१ तः ०.३%; डीएमएसओ; डी८४१८, सिग्मा-एल्ड्रिच्) इत्यस्मिन् विलीनः अभवत् । प्रयुक्तस्य DMSO इत्यस्य सान्द्रतायाः अध्ययनं कृतेषु न्यूरॉन्सेषु कोऽपि महत्त्वपूर्णः प्रभावः नासीत् । मुष्टिप्रहारप्रक्रियायाः कालखण्डे चैनलप्रतिरोधस्य (Ra) निरन्तरं निरीक्षणं कृतम्, तथा च Ra तथा AP इत्येतयोः आयामस्य स्थिरीकरणानन्तरं (२०-४० निमेषाः) प्रयोगः आरब्धः स्वतःस्फूर्तक्रियाकलापः वोल्टेज-अथवा धारा-क्लैम्प-मध्ये २ तः ५ निमेषपर्यन्तं माप्यते । Igor Pro (संस्करण 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (संस्करण 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) तथा GraphPad Prism (संस्करण 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) इत्येतयोः उपयोगेन आँकडा विश्लेषणं कृतम् संयुक्त राज्य अमेरिका)। स्वतःस्फूर्त एपी-परिचयार्थं IgorPro इत्यस्य NeuroMatic v3.0c प्लग-इन् इत्यस्य उपयोगः भवति । दत्तस्य सीमायाः उपयोगेन स्वयमेव एपी-परिचयः कुर्वन्तु, यत् प्रत्येकस्य अभिलेखस्य कृते व्यक्तिगतरूपेण समायोजितं भवति । स्पाइक-अन्तरस्य उपयोगेन अधिकतम-तत्क्षणिक-स्पाइक्-आवृत्त्या सह स्पाइक-आवृत्तिः, औसत-स्पाइक्-आवृत्तिः च निर्धारयन्तु ।
पीएन अलगाव। पूर्वं प्रकाशितप्रोटोकॉलस्य अनुकूलतां कृत्वा, पीएन्स् निर्दिष्टपदे मूषकस्य मस्तिष्ककोशात् शुद्धीकृताः (58) । संक्षेपेण, मस्तिष्कस्य विच्छेदनं कृत्वा हिमशीतविच्छेदनमाध्यमे [HBSS Ca2+ तथा Mg2+ विना, 20 mM ग्लूकोज, पेनिसिलिन (50 U/ml) तथा स्ट्रेप्टोमाइसिन् (0.05 mg/ ml) इत्यनेन पूरकं कृत्वा], ततः पपेन [HBSS, 1-cysteine·HCl इत्यनेन पूरकेण माध्यमं पचितम् (1 mg / ml), पपेन (16 U / ml) तथा डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियस I (DNase I; 0.1 mg/ml)] 30°C मध्ये 30 मिनिट् यावत् उपचारं कुर्वन्तु। प्रथमं अण्डस्य श्लेष्मा (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) तथा DNase (0.1 mg/ml) युक्ते HBSS माध्यमे एंजाइमी पाचनं निवारयितुं कक्षतापमाने ऊतकं प्रक्षाल्य, ततः 20 mM ग्लूकोज युक्ते HBSS माध्यमे HBSS, पेनिसिलिन् (50 U/ml), स्ट्रेप्टोमाइसिन् (0.05 mg/ml) तथा DNase (0.1 mg/ml) एककोशिकानां मुक्तिं करोति । परिणामस्वरूपं कोशिकानिलम्बनं 70μm कोशिका-छनीयाः माध्यमेन छानितम्, ततः कोशिकानां अपकेन्द्रीकरणेन (1110 rpm, 5 मिनिट्, 4°C) गोलीं कृत्वा क्रमणमाध्यमे [HBSS, 20 mM ग्लूकोज, 20% भ्रूणगोजातीय ) सीरम, पेनिसिलिन (50 U/ml) तथा स्ट्रेप्टोमाइसिन् इत्यनेन सह पूरितं पुनः निलम्बितम् (०.०५ मिग्रा / मिलीलीटर)]; प्रोपिडियम आयोडाइडेन सह कोशिकाजीवनक्षमतायाः मूल्याङ्कनं कुर्वन्ति तथा कोशिकाघनत्वं 1×106 तः 2×106 कोशिका/ml यावत् समायोजयन्ति। प्रवाहकोशिकामापनात् पूर्वं निलम्बनं ५० माइक्रोमीटर् कोशिकाछिद्रेण छानितम् आसीत् ।
प्रवाह कोशिकामापक। FACSAria III मशीन (BD Biosciences) तथा FACSDiva सॉफ्टवेयर (BD Biosciences, version 8.0.1) इत्येतयोः उपयोगेन 4°C इत्यत्र कोशिका-क्रमणं कृतम् । कोशिकानिलम्बनं ~2800 घटना/सेकण्ड् इत्यस्य दरेन 20 psi इत्यस्य दबावेन 100 μm नोजलस्य उपयोगेन क्रमबद्धम् आसीत् । यतो हि पारम्परिकाः गेटिंग् मापदण्डाः (कोशिकाकारः, द्विविधभेदः, तथा च प्रकीर्णनविशेषताः) अन्यकोशिकाप्रकारेभ्यः पीएनस्य सम्यक् पृथक्करणं सुनिश्चितं कर्तुं न शक्नुवन्ति, अतः गेटिंगरणनीतिः mitoYFP+ ​​तथा नियन्त्रण mitoYFP − मूषकेषु YFP तीव्रतायां स्वप्रतिदीप्तिषु च प्रत्यक्षतुलनायाः आधारेण सेट् भवति YFP 488 nm लेजररेखायाः सह नमूनायाः विकिरणं कृत्वा उत्तेजितः भवति, तथा च 530/30 nm बैण्ड् पास-छिद्रकस्य उपयोगेन संकेतस्य ज्ञापनं भवति । mitoYFP+ ​​मूषकेषु Rosa26-mitoYFP रिपोर्टर जीनस्य सापेक्षिकशक्तिः न्यूरॉनलशरीरस्य अक्षतंतुखण्डानां च भेदार्थं अपि उपयुज्यते । ७-एएडी ५६१ एनएम पीतलेजरेन उत्तेजितं भवति तथा च ६७५/२० एनएम बैण्डपास फ़िल्टर इत्यनेन मृतकोशिकानां बहिष्कारार्थं ज्ञायते । एकस्मिन् समये एस्ट्रोसाइट्स् पृथक् कर्तुं कोशिकानिलम्बनं ACSA-2-APC इत्यनेन वर्णितं, ततः नमूना 640 nm लेजररेखायाः विकिरणं कृतम्, संकेतस्य अन्वेषणार्थं 660/20 nm बैण्डपास-छिद्रकस्य उपयोगः कृतः
एकत्रितकोशिकानां अपकेन्द्रीकरणेन (१११० आरपीएम, ५ मिनिट्, ४ डिग्री सेल्सियस) गोलिकाकृताः, उपयोगपर्यन्तं -८० डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं संगृहीताः च । प्रक्रियागतविविधतां न्यूनीकर्तुं Mfn2cKO मूषकाणां तेषां कूपपिल्लानां च एकस्मिन् दिने वर्गीकरणं भवति । FACS आँकडा प्रस्तुतिः विश्लेषणं च FlowJo सॉफ्टवेयर (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) इत्यस्य उपयोगेन कृतम् ।
यथा उपरि उक्तं (59), तदनन्तरं mtDNA परिमाणनिर्धारणाय क्रमबद्धन्यूरोनतः DNA पृथक् कर्तुं वास्तविकसमयस्य PCR इत्यस्य उपयोगः भवति । रेखीयतायाः, सीमासंवेदनशीलतायाः च प्रारम्भे विभिन्नसङ्ख्यासु कोशिकासु qPCR चालयित्वा परीक्षणं कृतम् । संक्षेपेण 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 तथा proteinase K (200 ng/ml) इत्यनेन युक्ते लाइसिस् बफरमध्ये 300 PN एकत्रित्वा 55°C 120 मिनिट् यावत् इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु कोशिकानां 95°C मध्ये 10 मिनिट् यावत् इन्क्यूबेशनं कृत्वा प्रोटीनेज के पूर्णतया निष्क्रियीकरणं सुनिश्चितं कृतम् mt-Nd1 कृते विशिष्टस्य TaqMan अन्वेषणस्य (Thermo Fisher) उपयोगेन 7900HT Real-Time PCR प्रणाल्यां (Thermo Fisher Scientific) अर्ध-मात्रायां PCR द्वारा mtDNA मापनं कृतम् विज्ञान, सूची संख्या Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, सूची संख्या AIVI3E8) तथा 18S (Thermo Fisher Scientific, सूची संख्या Hs99999901_s1) जीन।
प्रोटीओम नमूना निर्माण। 95°C मध्ये 10 मिनिट् यावत् घोलं तापयित्वा सोनिकेशनं कृत्वा, लाइसिस बफर [6 M गुआनिडिन क्लोराइड, 10 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide तथा 100 mM tris- Lyse HCl मध्ये जमे न्यूरॉन् गोलियां बायोरुप्टर् (Diagenode) इत्यत्र १० मिनिट् (३० सेकण्ड् नाडी / ३० सेकण्ड् विरामकालः) यावत् । नमूना २० mM tris-HCl (pH 8.0) इत्यस्मिन् १:१० क्षीणं कृत्वा, ३०० ng trypsin gold (Promega) इत्यनेन सह मिश्रयित्वा, पूर्णपाचनं प्राप्तुं ३७°C इत्यत्र रात्रौ यावत् इन्क्यूबेट् कृतम् द्वितीयदिने नमूना २०,००० ग्रामे २० निमेषपर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणं कृतम् । उपरितनं ०.१% फॉर्मिक-अम्लेन क्षीणं कृत्वा, स्वयमेव निर्मितेन StageTips इत्यनेन विलयनं विलवणं कृतम् । नमूना SpeedVac यन्त्रे (Eppendorf concentrator plus 5305) 45°C मध्ये शुष्कं कृतम्, ततः पेप्टाइड् 0.1% फॉर्मिक अम्लस्य मध्ये निलम्बितम् सर्वे नमूनाः एकेन एव व्यक्तिना युगपत् निर्मिताः आसन् । एस्ट्रोसाइट् नमूनानां विश्लेषणार्थं 4 μg विलवणरहितपेप्टाइड्-इत्येतत् १:२० पेप्टाइड्-टीएमटी-अभिकर्मक-अनुपातेन सह टैण्डम्-मास-टैग् (TMT10plex, कैटलॉग-सङ्ख्या ९०११०, थर्मो फिशर-वैज्ञानिक) इत्यनेन लेबलं कृतम् TMT लेबलिंग् कृते 0.8 mg TMT अभिकर्मकं 70 μl निर्जल ACN इत्यस्मिन् पुनः निलम्बितम्, तथा च शुष्कं पेप्टाइडं 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) इत्यस्य 9 μl इत्यस्मिन् पुनर्गठनं कृतम्, यस्मिन् ACN इत्यस्मिन् 7 μl TMT अभिकर्मकं योजितम् सान्द्रता ४३.७५% आसीत् । ६० निमेषपर्यन्तं ऊष्मायनानन्तरं २ μl ५% हाइड्रोक्सिलामाइन् इत्यनेन विक्रिया शमनं कृतम् । लेबलयुक्तानि पेप्टाइड्स् एकत्रितानि, शोषयित्वा, 0.1% फॉर्मिक-अम्ले (FA) 200μl पुनः लम्बितानि, द्वयोः विभक्ताः, ततः स्वनिर्मित-स्टेजटिप्स्-इत्यस्य उपयोगेन लवणं विमुक्ताः UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) इत्यस्य उपयोगेन, द्वयोः आर्धयोः एकस्य 1mm x 150mm Acquity क्रोमैटोग्राफिक स्तम्भे 130Å1.7μm C18 कणैः (Waters, catalog No. SKU: 186006935) पूरितस्य विभाजनं कृतम् थर्मो फिशर वैज्ञानिक)। 30μl/min प्रवाहदरेण पेप्टाइड् पृथक् कुर्वन्तु, 1% तः 50% बफर B तः 85 निमेषपर्यन्तं 96 निमेषस्य चरणबद्ध ढालेन, 50% तः 95% बफर B 3 निमेषपर्यन्तं, ततः 95 % बफर B कृते 8 निमेषान् यावत् बफर A ५% ACN तथा १० mM अमोनियम बाइकार्बोनेट् (ABC), बफर B ८०% ACN तथा १० mM ABC भवति । प्रत्येकं ३ निमेषेषु अंशान् सङ्गृह्य द्वयोः समूहयोः (१ + १७, २ + १८ इत्यादयः) संयोजयित्वा वैक्यूम अपकेन्द्रे शोषयन्तु ।
LC-MS/MS विश्लेषण। द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री कृते पेप्टाइड्स् (संख्या r119.aq) 25 सेमी, 75 माइक्रोन आन्तरिकव्यासस्य PicoFrit विश्लेषणात्मकस्तम्भे (नवीन उद्देश्यलेन्स, भागसङ्ख्या PF7508250) 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ माध्यमेन (Dr. Maisch, mat), EASY-nLC इत्यस्य उपयोगेन सुसज्जिते पृथक्कृताः आसन् १२०० (थर्मो फिशर साइंटिफिक, जर्मनी)। स्तम्भः ५० डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं स्थापितः । बफर ए तथा ख क्रमशः ०.१% फॉर्मिक अम्लं जले, ०.१% फॉर्मिक अम्लं ८०% एसीएन् मध्ये च भवति । पेप्टाइड् ६% तः ३१% बफर B पर्यन्तं ६५ निमेषपर्यन्तं, ३१% तः ५०% बफर B पर्यन्तं च ५ निमेषपर्यन्तं २०० nl/min इति चरणबद्धेन ढालेन पृथक् कृतम् इल्यूट्ड् पेप्टाइड् इत्यस्य विश्लेषणं Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) इत्यनेन कृतम् । पेप्टाइड् पूर्ववर्ती m/z मापनं ३५० तः १५०० m/z पर्यन्तं १२०,००० रिजोल्यूशनेन क्रियते । 27% सामान्यीकृत-टकराव-ऊर्जायाः उपयोगेन, उच्च-ऊर्जा C जाल-विच्छेदनस्य (HCD) विच्छेदनार्थं 2 तः 6 पर्यन्तं आभार-स्थित्या सह सशक्ततमं पूर्ववर्ती चयनं भवति चक्रसमयः १ s इति सेट् भवति । पेप्टाइडखण्डस्य m/z मूल्यं आयनजालस्य लघुतमं AGC लक्ष्यं 5×104 इत्यस्य अधिकतमं इन्जेक्शनसमयं 86 ms इत्यस्य उपयोगेन मापितं विखण्डनस्य अनन्तरं पूर्ववर्ती गतिशीलबहिष्कारसूचौ ४५ s यावत् स्थापितः । TMT-लेबलयुक्ताः पेप्टाइडाः 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap स्तम्भे (Thermo Fisher Scientific, catalog number 164942) पृथक् कृतवन्तः, तथा च उच्चक्षेत्रसममिततरङ्गरूपआयनैः (FAIMS) उपकरणैः सुसज्जितेन Orbitrap Lumos Tribrid मास स्पेक्ट्रोमीटर् (Thermo Fisher Scientific) इत्यत्र प्रवासन स्पेक्ट्राणां विश्लेषणं कृतम् (Thermo Fisher Scientific) −50 तथा −70 V इत्येतयोः क्षतिपूर्तिवोल्टेजयोः कार्यं करोति समन्वयनपूर्ववर्तीयाः आधारेण चयनितं MS3 TMT रिपोर्ट आयनसंकेतमापनार्थं उपयुज्यते पेप्टाइड पृथक्करणं EASY-nLC 1200 इत्यत्र 90% रेखीय ढालविलोपनस्य उपयोगेन, 6% तः 31% पर्यन्तं बफरसान्द्रतायाः सह; बफर ए ०.१% FA, बफर B च ०.१% FA, ८०% ACN च आसीत् । विश्लेषणात्मकस्तम्भः ५० डिग्री सेल्सियसपर्यन्तं संचालितः भवति । FAIMS क्षतिपूर्तिवोल्टेजस्य अनुसारं मूलसञ्चिकां विभक्तुं FreeStyle (संस्करणं 1.6, Thermo Fisher Scientific) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु ।
प्रोटीनपरिचयः परिमाणीकरणं च। एकीकृत एण्ड्रोमेडा अन्वेषणयन्त्रस्य उपयोगेन मूलदत्तांशस्य विश्लेषणं MaxQuant संस्करणं १.५.२.८ (https://maxquant.org/) इत्यस्य उपयोगेन कृतम् । Aequorea victoria तः प्राप्तस्य Cre recombinase तथा YFP अनुक्रमस्य अतिरिक्तं, पेप्टाइडखण्ड स्पेक्ट्रा माउस सन्दर्भप्रोटीओम (Proteome ID UP000000589, मे 2017 तमे वर्षे UniProt तः डाउनलोड् कृतस्य) इत्यस्य कैनोनिकल अनुक्रमस्य आइसोफॉर्म अनुक्रमस्य च अन्वेषणं कृतम् मेथियोनिन् आक्सीडेशनं प्रोटीन एन-टर्मिनल एसिटाइलेशनं च चरसंशोधनरूपेण सेट् कृतम्; सिस्टीन कार्बामोइल मिथाइलेशनं नियतसंशोधनरूपेण निर्धारितम् आसीत् । पाचनमापदण्डाः “specificity” तथा “trypsin/P” इति सेट् भवन्ति । प्रोटीनपरिचयार्थं प्रयुक्तानां पेप्टाइड्-रेजर-पेप्टाइड्-योः न्यूनतमा संख्या १ भवति; अद्वितीयपेप्टाइड्-सङ्ख्यायाः न्यूनतमः ०.पेप्टाइड्-नक्शा-मेलनस्य परिस्थितौ प्रोटीन-परिचय-दरः ०.०१ आसीत् । “Second Peptide” विकल्पः सक्षमः अस्ति । भिन्न-भिन्न-मूल-सञ्चिकानां मध्ये सफल-परिचयः स्थानान्तरयितुं “match between runs” विकल्पस्य उपयोगं कुर्वन्तु । लेबल-रहित-मात्रानिर्धारणाय (LFQ) (60) LFQ न्यूनतम-अनुपात-गणना 1 इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । LFQ तीव्रता प्रत्येकं समयबिन्दौ न्यूनातिन्यूनम् एकस्मिन् जीनोटाइपसमूहे न्यूनातिन्यूनं द्वयोः वैधमूल्ययोः कृते फ़िल्टर भवति, तथा च सामान्यवितरणात् बहिः प्रक्षेपणं भवति यस्य विस्तारः भवति ०.३ अधः गत्वा १.८ । LFQ परिणामानां विश्लेषणार्थं Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) तथा R (https://r-project.org/) इत्येतयोः उपयोगं कुर्वन्तु । विभेदकव्यञ्जनविश्लेषणार्थं लिम्मासॉफ्टवेयरसङ्कुलात् द्विपक्षीयमध्यमटीपरीक्षायाः उपयोगः कृतः (61) । अन्वेषणात्मकदत्तांशविश्लेषणं ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally तथा pheatmap इत्येतयोः उपयोगेन क्रियते । TMT-आधारितस्य प्रोटीओमिक्स-दत्तांशस्य विश्लेषणं MaxQuant संस्करणं 1.6.10.43 इत्यस्य उपयोगेन कृतम् । UniProt इत्यस्य मानवप्रोटीओमिक्सदत्तांशकोशे कच्चा प्रोटीओमिक्सदत्तांशं अन्वेष्टुम्, यत् सितम्बर २०१८ तमे वर्षे डाउनलोड् कृतम् आसीत् ।विश्लेषणे निर्मातृणां प्रदत्तं समस्थानिकशुद्धतासुधारकारकं समावेशितम् अस्ति विभेदकव्यञ्जनविश्लेषणार्थं R इत्यस्मिन् लिम्मा इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु। मूलदत्तांशः, आँकडाधारसन्धानपरिणामाः, आँकडाविश्लेषणकार्यप्रवाहः परिणामाः च सर्वे PRIDE भागीदारभण्डारस्य माध्यमेन ProteomeXchange गठबन्धने आँकडासमूहपरिचयकर्ता PXD019690 इत्यनेन सह संगृहीताः सन्ति
कार्यात्मकटिप्पणयः विश्लेषणं समृद्धयन्ति। 8 सप्ताहेषु आँकडा-समूहस्य कार्यात्मक-टिप्पणी-पदानां समृद्धि-निर्धारणाय Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) साधनस्य उपयोगः कृतः (चित्रम् 1) संक्षेपेण, LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) आँकडा विश्लेषणात् प्राप्तस्य परिमाणात्मकस्य प्रोटीनसूचिकायाः ​​उपयोगः निम्नलिखित-छिद्रक-मापदण्डेन सह भवति: Mus musculus इत्यस्य चयनं प्रजातिरूपेण पृष्ठभूमिं च भवति, तथा च श्रेणी 0.05 अथवा तस्मात् न्यूनसमृद्ध्यर्थं बेन्जामिनेन समायोजितं P मूल्यं दर्शयति यत् महत्त्वपूर्णं मन्यते। अस्य आलेखस्य कृते समायोजितस्य P मूल्यस्य आधारेण प्रत्येकस्मिन् समूहे शीर्षपञ्च अतिरिक्तवर्गाः दर्शिताः सन्ति । बहु-टी-परीक्षणस्य उपयोगेन, बेन्जामिन, क्रिगर, येकुतिएली (Q = 5%) इत्येतयोः द्विचरणीय-रेखीय-बूस्ट-कार्यक्रमस्य उपयोगेन, प्रत्येकस्मिन् वर्गे चिह्नितानां महत्त्वपूर्ण-अभ्यर्थीनां उपरि समय-पाठ्यक्रम-प्रोटीन-अभिव्यक्ति-विश्लेषणं क्रियते, तथा च प्रत्येकं पङ्क्तिं पृथक् पृथक् विश्लेषितं भवति सुसंगतं एसडी स्वीकुर्वितुं आवश्यकता नास्ति।
अस्य अध्ययनस्य परिणामानां प्रकाशितदत्तांशकोशैः सह तुलनां कर्तुं तथा चित्रे 1 Venn आरेखं जनयितुं वयं MitoCarta 2.0 टिप्पणीभिः सह परिमाणात्मकप्रोटीनसूचीं संयोजितवन्तः (24)। आरेखं जनयितुं Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) इति ऑनलाइन-उपकरणस्य उपयोगं कुर्वन्तु ।
प्रोटीओमिक्स विश्लेषणार्थं प्रयुक्तानां सांख्यिकीयप्रक्रियाणां विस्तृतसूचनार्थं कृपया सामग्रीविधिः इति तत्सम्बद्धं विभागं पश्यन्तु । अन्येषां सर्वेषां प्रयोगानां कृते तत्सम्बद्धे आख्यायिकायां विस्तृतसूचना प्राप्यते । अन्यथा निर्दिष्टं न भवति चेत्, सर्वाणि आँकडानि औसत ± SEM इति रूपेण व्यक्तानि सन्ति, तथा च सर्वाणि सांख्यिकीयविश्लेषणं GraphPad Prism 8.1.2 सॉफ्टवेयरस्य उपयोगेन कृतम्
अस्य लेखस्य पूरकसामग्रीणां कृते कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 पश्यन्तु
एषः क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-वाणिज्यिक-अनुज्ञापत्रस्य शर्तानाम् अन्तर्गतं वितरितः मुक्त-प्रवेश-लेखः अस्ति, यः कस्मिन् अपि माध्यमे उपयोगं, वितरणं, पुनरुत्पादनं च अनुमन्यते, यावत् अन्तिमः उपयोगः व्यावसायिकलाभार्थं न भवति तथा च आधारः अस्ति यत् मूलकार्यं सम्यक् अस्ति सन्दर्भः।
नोटः- वयं केवलं भवन्तं भवतः ईमेल-सङ्केतं प्रदातुम् याचयामः येन भवन्तः पृष्ठे अनुशंसिताः व्यक्तिः ज्ञास्यति यत् भवन्तः इच्छन्ति यत् ते ईमेल-पत्रं द्रष्टुम् इच्छन्ति तथा च एतत् स्पैम् नास्ति इति। वयं किमपि ईमेल-सङ्केतं न गृह्णीमः ।
एषः प्रश्नः भवान् आगन्तुकः अस्ति वा इति परीक्षितुं स्वयमेव स्पैम-प्रदानं निवारयितुं च उपयुज्यते ।
ई मोटोरी, आई अतनास्सोव, एस एम वी कोचन, के फोल्ज-डोनाहुए, वी सक्थिवेलु, पी जियावालिस्को, एन टोनी, जे पुयल, एन-जी द्वारा। लार्सन्
अकार्यकरन्यूरोनानां प्रोटीओमिक्सविश्लेषणेन ज्ञातं यत् न्यूरोडीजनरेशनस्य प्रतिकारार्थं चयापचयकार्यक्रमाः सक्रियताम् अवाप्नुवन्ति ।
ई मोटोरी, आई अतनास्सोव, एस एम वी कोचन, के फोल्ज-डोनाहुए, वी सक्थिवेलु, पी जियावालिस्को, एन टोनी, जे पुयल, एन-जी द्वारा। लार्सन्
अकार्यकरन्यूरोनानां प्रोटीओमिक्सविश्लेषणेन ज्ञातं यत् न्यूरोडीजनरेशनस्य प्रतिकारार्थं चयापचयकार्यक्रमाः सक्रियताम् अवाप्नुवन्ति ।
©2020 अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द एडवांसमेण्ट् आफ् साइंस। सर्वे अधिकाराः सुरक्षिताः। एएएएस HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef तथा COUNTER इत्येतयोः भागीदारः अस्ति । विज्ञान उन्नति ISSN 2375-2548.