वर्तमान†वर्तमान पता: OX11 0DE, यूके, हीरा भवन, हार्वेल विज्ञान एवं नवीनता पार्क, डायटकोट, ऑक्सफोर्डशायर, यूके, हीरा प्रकाश स्रोत कं, लिमिटेड, इलेक्ट्रॉनिक जैविक इमेजिंग केन्द्र।
प्रतिक्रियाकेन्द्रप्रकाश-कटनी-संकुलः १ (RC-LH1) बैंगनी-प्रकाशसंश्लेषणीयजीवाणुनां मूलप्रकाशसंश्लेषणघटकः अस्ति । वयं Rhodopseudomonas palustris इत्यस्मात् RC-LH1 परिसरस्य द्वे क्रायो-इलेक्ट्रॉनसूक्ष्मदर्शनसंरचनायाः परिचयं कृतवन्तः। RC-LH114-W परिसरस्य 2.65-Å रिजोल्यूशनसंरचनायां RC परितः 14 उप-इकाई LH1 लूप्स् भवन्ति, यत् प्रोटीन W द्वारा बाधितं भवति, यदा तु प्रोटीन-W विना परिसरः RC द्वारा परितः पूर्णतया RC रचना भवति बन्द 16 उप-इकाई LH1 पाश। एतेषां संरचनानां तुलना आरसी-एलएच१ परिसरे क्विनोनस्य गतिशीलतायाः अन्वेषणं प्रदाति, यत्र आरसी क्यूबी स्थले क्विनोनस्य बन्धनस्य समये पूर्वं अनिर्धारितसंरचनात्मकपरिवर्तनानि सन्ति, तथैव सहायकक्विनोनबन्धनस्थलानां स्थानं च, ये तान् आरसी-पर्यन्तं पारयितुं साहाय्यं कुर्वन्ति W प्रोटीनस्य अद्वितीयसंरचना LH1 पाशस्य बन्दीकरणं निवारयति, तस्मात् क्विनोन्/क्विनोलोन् आदानप्रदानस्य त्वरिततायै एकः चैनलः निर्मीयते ।
प्रकाशसंश्लेषणेन प्रदत्ता ऊर्जा पृथिव्यां प्रायः सर्वाणि जीवनानि स्थापयितुं शक्नोति, सौरजैवप्रौद्योगिक्याः अपि महती क्षमता अस्ति । वैश्विकप्रकाशसंश्लेषणं प्रवर्धयन् बैंगनी प्रकाशभक्षकजीवाणुः विविधानि ऊर्जाविधानानि चयापचयक्षमतां च प्रदर्शयन्ति । ते प्रकाशसंश्लेषणं परिहरितुं शक्नुवन्ति, अन्धकारे विषमजीवजीवाणुरूपेण वर्धयितुं शक्नुवन्ति, नाइट्रोजनं कार्बनडाय-आक्साइडं च निश्चेतुं शक्नुवन्ति, हाइड्रोजनं उत्पादयितुं शक्नुवन्ति, सुगन्धितसंयुतानां अवनतिं च कर्तुं शक्नुवन्ति (१-३) एतेषां प्रक्रियाणां कृते ऊर्जां प्रदातुं प्रकाशस्य शीघ्रं कुशलतया च रासायनिकशक्तिरूपेण परिवर्तनं करणीयम् । इयं प्रक्रिया तदा आरभ्यते यदा प्रकाश-जाल-अन्तेना-सङ्कुलः प्रकाशं अवशोषयति, फसित-ऊर्जाम् प्रतिक्रिया-केन्द्रं (RC) प्रति स्थानान्तरयति, तस्मात् आभार-पृथक्करणं आरभ्यते (4 – 7) बैंगनी प्रकाशभक्षी जीवाणुषु प्रकाशसंश्लेषणस्य मूलभूतं इकाई प्रकार 2 आरसी इत्यनेन निर्मितं भवति, यत् प्रकाश-कटनी-सङ्कुलेन 1 (LH1) इत्यनेन परितः भवति, यत् RC-LH1 कोर-सङ्कुलं निर्माति LH1 वक्र αβ विषमजीवानां सरणीद्वारा निर्मितं भवति, येषु प्रत्येकं जीवाणुक्लोरोफिल् (BChl) a अणुद्वयं एकं वा कैरोटीनोइड्द्वयं वा (8-12) बन्धयति सरलतमः LH1 एंटीना 16 वा 17 αβ विषमडाइमरैः युक्तः भवति ये RC (9-13) इत्यस्य बन्दपाशस्य परितः भवन्ति, परन्तु अन्येषु कोर परिसरेषु, ट्रांसमेम्ब्रेन पेप्टाइड्स् आसपासस्य LH1 इत्यस्य निरन्तरताम् बाधन्ते , अतः आरसी तथा साइटोक्रोम bc1 परिसरस्य (11, 11) इत्येतयोः मध्ये क्विनोल्/क्विनोन प्रसारं प्रवर्धयन्ति । १३-१५) इति । बैंगनीवर्णीयः प्रकाशोत्पादकः पादपः Rhodopseudomonas (Rps.) एकः आदर्शजीवः अस्ति यः प्रकाशसंश्लेषणस्य समर्थनं कुर्वन् ऊर्जां इलेक्ट्रॉन् स्थानान्तरणं च अवगन्तुं शक्नोति । प्रथमा स्फटिकसंरचना Rps. पलुस्ट्रिस् आरसी-एलएच१ परिसरस्य प्रतिरूपं आरसी अस्ति, यत् १५ हेट्रोडाइमेरिक एलएच१ पाशैः परितः अस्ति, ये “प्रोटीन डब्ल्यू” (१४) इति नाम्ना अज्ञातेन प्रोटीनेन बाधिताः भवन्ति तदनन्तरं प्रोटीन-डब्ल्यू इत्यस्य पहिचानः RPA4402 इति कृतः, यः त्रयः पूर्वानुमानिताः ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स (TMH) (16) युक्तः अचरित्रः 10.5kDa प्रोटीनः अस्ति । वयं RC-L, M (pufL, pufM) तथा LH1α, β (pufA, pufB) उप-इकायानां संकेतकं जीनानां कृते प्रयुक्तस्य नामकरणस्य अनुरूपं भवितुं प्रोटीन W एन्कोडिंगं rpa4402 जीनस्य नामकरणं pufW इति प्रस्तावयामः। रोचकं तत् अस्ति यत् प्रोटीन-डब्ल्यू केवलं आरसी-एलएच१ इत्यस्य प्रायः १०% भागे एव वर्तते, येन Rps. palustris इत्यनेन द्वौ भिन्नौ RC-LH1 परिसरौ उत्पाद्यते । अत्र, वयं द्वयोः कोर-सङ्कुलयोः उच्च-संकल्प-क्रायो-ईएम (क्राय-ईएम) संरचनानां सूचनां दद्मः, एकः प्रोटीन-डब्ल्यू तथा 14 αβ विषम-डाइमर-युक्तः, अन्यः प्रोटीन-डब्ल्यू-रहितः, एकः बन्दः 16 हेटरोडाइमर-एलएच1-पाशः च अस्ति अस्माकं संरचना Rps इत्यस्य RC-LH1 परिसरस्य अवगमने एकं चरणपरिवर्तनं प्रतिनिधियति। palustris, यतः अस्माभिः प्रत्येकस्य रूपान्तरस्य सजातीयजनसंख्यायाः विश्लेषणं कृतम् अस्ति तथा च प्रत्येकं पेप्टाइडं तथा बद्धं वर्णकं तथा सम्बन्धितं लिपिड् तथा क्विनोन् स्पष्टतया नियुक्तुं पर्याप्तः संकल्पः अस्ति। एतेषां संरचनानां तुलनायां ज्ञायते यत् अन्येषु कस्मिन् अपि RC-LH1 परिसरे अद्यावधि न प्राप्ताः त्रयः TMH प्रोटीन्-W क्विनोन्/क्विनोलोन् आदानप्रदानं त्वरयितुं क्विनोन् चैनलं जनयन्ति संरक्षितलिपिड-क्विनोन-बन्धनस्थलानां संख्या चिह्निता अस्ति, अस्माभिः च क्विनोन-आरसी-संयोजनानन्तरं नूतनं संरचनात्मकं परिवर्तनं प्रकाशितम्, यत् आक्सीजनयुक्त-प्रकाश-भोजक-जीवानां प्रकाश-प्रणाली II (PSII) आरसी-कृते उपयुक्तं भवितुम् अर्हति अस्माकं निष्कर्षाः बैंगनी प्रकाशभक्षी जीवाणुनां RC-LH1 कोर परिसरे क्विनोन/क्विनोलोन बन्धनस्य आदानप्रदानस्य च गतिविज्ञानस्य विषये नवीनं अन्वेषणं प्रददति।
Rps मध्ये प्राप्तयोः परिसरयोः विस्तृत अध्ययनस्य सुविधायै । palustris, वयं जैवरासायनिकपद्धत्या प्रत्येकं RC-LH1 पृथक् कुर्मः। प्रोटीन W-अभावयुक्तं परिसरं (अतः परं ΔpufW इति उच्यते) pufW जीनस्य अभावयुक्तात् तनावात् शुद्धं कृतम् (16), केवलं एकं RC-LH1 परिसरं उत्पादयितुं शक्यते प्रोटीन W-युक्तं परिसरं एकेन तनावेन उत्पाद्यते । अस्य तनावस्य प्रोटीन W तस्य C-अन्तस्थाने 10x His टैग् इत्यनेन परिवर्तितं भवति, येन प्रोटीन W युक्तं परिसरं धातुं स्थिरं कृत्वा अधिकांशतः अभावयुक्तेन प्रोटीन W इत्यनेन सह प्रभावीरूपेण संयोजितुं शक्यते परिसरः प्रभावीरूपेण पृथक् भवति (16) Affinity Chromatography (IMAC) ।
यथा चित्रे १ दर्शितं, द्वयोः परिसरयोः LH1 एंटीनाद्वारा परितः त्रीणि उप-एककानि RC (RC-L, RC-M तथा RC-H) भवन्ति । प्रोटीन-W अभावयुक्तस्य परिसरस्य 2.80-A संरचना 16 αβ विषमडाइमर् दर्शयति, यत् RC पूर्णतया परितः एकं बन्दं LH1 पाशं निर्माति, अतः परं RC-LH116 परिसरः इति उच्यते प्रोटीन-डब्ल्यू-युक्तस्य परिसरस्य २.६५Å संरचनायां प्रोटीन-डब्ल्यू द्वारा बाधितं १४-विषम-डाइमर LH1 भवति, अतः परं RC-LH114-W इति उच्यते
(A and B) समासस्य पृष्ठीयप्रतिपादनम्। (C and D) दण्डेषु व्यक्ताः बन्धिताः वर्णकाः। (E and F) कोशिकाद्रव्यपृष्ठतः अवलोकितानां संकुलानाम् कार्टुन्-चित्रेषु प्रतिनिधित्वं कृत्वा पेप्टाइड्-एलएच१ उप-एककाः सन्ति, तथा च प्रोटीन-डब्ल्यू-अन्तरात् [Rba-सङ्ख्याकरणेन सह सङ्गतम्] घड़ी-दिशायां संख्याकृताः सन्ति sphaeroides परिसर (13)]। LH1-α कृते प्रोटीन उप-एककस्य वर्णः पीतः भवति; LH1-β कृते प्रोटीन उप-एककस्य वर्णः नीलः भवति; प्रोटीन-डब्ल्यू कृते प्रोटीनं रक्तवर्णीयं भवति; आरसी-एच् कृते सियन् अस्ति; आरसी-एल कृते, तत् नारङ्गवर्णम् अस्ति; आरसी-एम कृते, मैजेन्टा। सहकारकाणां प्रतिनिधित्वं दण्डैः भवति, हरितः BChl तथा BPh a अणुः, बैंगनीवर्णः कैरोटीनोइड्, पीतः च UQ10 अणुः प्रतिनिधियति । (G and H) RC-LH114-W परिसरस्य (G) तथा RC-LH116 परिसरस्य (H) समतुल्यक्षेत्रे प्रोटीन-W अन्तरालस्य वर्धितदृश्यम्। सहकारकाः स्थानपूरणरूपेण प्रदर्शिताः भवन्ति, किलेटेड् क्विनोन् नीलवर्णेन प्रदर्शितः भवति । प्रोटीन-W अन्तरं (G) मध्ये नीलवर्णीयेन विच्छिन्नरेखायाः माध्यमेन प्रकाशितं भवति, तथा च LH116 वलयस्य उपरि यत्र क्विनोन्/क्विनोलोल् प्रसरति तत्र लघुछिद्राणि (H) मध्ये कृष्णवर्णीयेन विच्छिन्नरेखायाः माध्यमेन प्रकाशितानि सन्ति
चित्र 1 (A and B) LH1αβ हेटरोडाइमरस्य खुले अथवा बन्दसरणौ परितः आरसी दर्शयति, येषु प्रत्येकं द्वौ BChl एकं च कैरोटीनोइड् (चित्रं 1, C तथा D) बन्धयति पूर्वाध्ययनेन ज्ञातं यत् Rps LH1 परिसरः अस्ति । स्पाइरुलिना ज़ैन्थिन् इत्यस्य जैवसंश्लेषणमार्गे एतेषु प्रजातीषु कैरोटीनोइड् इत्यस्य मिश्रितजनसंख्या भवति (१७) । परन्तु स्पाइरोपाइरोक्सान्थिन् प्रमुखं कैरोटीनोइड् अस्ति, तस्य घनत्वं च सन्तोषजनकम् अस्ति । अतः वयं सर्वेषु LH1 बन्धनस्थलेषु स्पाइरोक्सान्थिनस्य प्रतिरूपणं कर्तुं चयनं कृतवन्तः । अल्फा तथा बीटा पॉलीपेप्टाइड् एकल टीएमएच् भवति यस्याः लघुझिल्लीबाह्यप्रदेशाः सन्ति (चित्रम् १, ए, ख, ई, एफ च) । यद्यपि C-अन्तस्थाने १७ अवशेषाणां घनत्वं न अवलोकितम्, तथापि उभयसङ्कुलयोः आल्फा-पॉलीपेप्टाइड् Met1 तः Ala46 पर्यन्तं विच्छेदितम् β पॉलीपेप्टाइड् RC-LH116 इत्यस्मिन् Gly4 तः Tyr52 यावत्, आरसी-LH114-W इत्यस्मिन् Ser5 तः Tyr52 यावत् न्यूनीकृतम् । 3 अथवा 4 N-अन्तस्य अथवा 13 C-अन्तस्य अवशेषस्य घनत्वं न दृष्टम् (चित्रम् S1) । वन्यप्रकारस्य तनावात् निर्मितस्य मिश्रितस्य RC-LH1 परिसरस्य द्रव्यमानवर्णक्रममापनविश्लेषणेन ज्ञातं यत् अनुपलब्धः क्षेत्रः एतेषां पेप्टाइडानां विषमविच्छेदनस्य परिणामः आसीत् (चित्रं S1 तथा S2)। α-Met1 इत्यस्य N-अन्तीयरूपीकरणम् अपि अवलोकितम् (f) । विश्लेषणेन ज्ञातं यत् α-पेप्टाइड् मध्ये fMet1 तः Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 पर्यन्तं अवशेषाः सन्ति, तथा च β-पेप्टाइड् मध्ये Ser2 तः Ala53 पर्यन्तं अवशेषाः सन्ति, यत् न्यूनतापमानस्य EM घनत्वमानचित्रेण सह उत्तमं सहमतिः अस्ति
α-His29 तथा β-His36 इत्येतयोः समन्वयेन BChls इत्यस्य साक्षात्कारः भवति; प्रत्येकं αβ विषमयुग्मकं स्वपरिजनेन सह मिलित्वा आरसी The exciton coupled pigment array (चित्र 1, C and D) इत्यस्य परितः एकं खुलं पाशं (RC-LH114-W) अथवा एकं बन्दपाशं (RC-LH116) निर्माति RC-LH114-W इत्यस्य 877 nm पट्टिकायाः ​​तुलने RC-LH116 इत्यस्य 880 nm अवशोषणलालशिफ्टः 3 nm भवति (चित्रम् 2A) । परन्तु वृत्ताकारद्विवर्णतावर्णक्रमः प्रायः समानः एव (चित्रम् २ बी), यत् सूचयति यत् यद्यपि मुक्तपाशयोः बन्दपाशयोः मध्ये स्पष्टः अन्तरः अस्ति तथापि बीसीएच्ल्सस्य स्थानीयवातावरणं बहु समानम् अस्ति अवशोषण-लाल-विस्थापनं बन्द-पाशस्य (१८, १९), बन्द-पाशस्य (२०, २१) कारणेन वर्णक-युग्मनस्य परिवर्तनस्य, अथवा एतयोः प्रभावयोः (११) संयोजनस्य परिणामः भवितुम् अर्हति
(A) पराबैंगनी/दृश्यमान/अवरक्त-समीप-अवरक्तशोषणवर्णक्रमः, यस्य शिखराः तेषां तत्सम्बद्धैः वर्णकैः चिह्निताः भवन्ति तथा च 775 एनएम इत्यत्र BPh शिखरं प्रति सामान्यीकृताः भवन्ति। (B) 805 एनएम पर BChl अवशोषणं प्रति सामान्यीकृत वृत्ताकार द्विवर्णता स्पेक्ट्रम। (C and D) RC-LH114-W परिसर (C) तथा RC-LH116 परिसर (D) के समय-निराकरण अवशोषण स्पेक्ट्राओं से चयनित ΔA स्पेक्ट्रा। उत्तमतुलनीयतायै सर्वे स्पेक्ट्राः 0.2 ps इत्यत्र −A इत्यस्य ∆A इत्येव सामान्यीकृताः भवन्ति । (E) UQ2 इत्यस्य विभिन्नसान्द्रतायाः उपस्थितौ विकिरणस्य अनन्तरं साइटोक्रोम c2 ऑक्सीकरणस्य दरः (कच्चा आँकडानां कृते चित्रं S8 पश्यन्तु)। (F) न्यून-मध्यम-उच्च-तीव्रता-प्रकाशस्य (क्रमशः १०, ३० वा ३००μMm-2 s-1) अन्तर्गतं वर्धितेषु कोशिकासु शुद्ध-सङ्कुलस्य प्रोटीन-डब्ल्यू तथा आरसी-एल उप-एककाः पृथक्कृत-झिल्ली-अनुपातः च SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoassay इत्यनेन प्रोटीनस्तरं निर्धारयन्तु (कच्चा आँकडानां कृते चित्रं S9 पश्यन्तु)। शुद्ध RC-LH114-W परिसरस्य सापेक्षं अनुपातं निर्धारयन्तु। परिसरस्य RC-L इत्यस्य प्रोटीन-W इत्यस्य च स्टोइकियोमेट्रिक अनुपातः १:१ भवति ।
RC-LH114-W (चित्रम् 1, A, C, तथा E) इत्यस्य विकृते αβ14 लूप् इत्यस्मिन् 1 स्थाने स्थिताः BChls आरसी-LH116 इत्यस्मिन् समतुल्य BChls इत्यस्य अपेक्षया 6.8Å इत्यनेन आरसी प्राथमिकदातुः (P) इत्यस्य समीपे सन्ति (चित्रम् 1, B, D, तथा F, तथा चित्रं S3) तथापि, द्वयोः परिसरयोः क्षणिकशोषणगतिविज्ञानं दर्शयति यत् RC-LH114-W तथा RC-LH116 इत्येतयोः कृते LH1 तः RC पर्यन्तं उत्तेजना ऊर्जा स्थानान्तरणसमयस्थिरांकाः 40 ±4 तथा 44±3 ps भवन्ति (चित्रम् 2) , C and D, चित्र S4 तथा सारणी S2)। आरसी-अन्तर्गतं इलेक्ट्रॉनिक-स्थानांतरणे अपि कोऽपि महत्त्वपूर्णः अन्तरः नास्ति (चित्रम् S5 तथा तत्सम्बद्धः पूरक-पाठः) । अस्माकं शङ्कास्ति यत् LH1 तथा RC-P इत्येतयोः मध्ये ऊर्जास्थानांतरणसमयस्य निकटसङ्गतिः LH1 पाशद्वये अधिकांशस्य BChl इत्यस्य समानदूरता, कोणः, सम्भाव्य ऊर्जा च इति कारणेन भवति इदं प्रतीयते यत् न्यूनतमदूरं प्राप्तुं LH1 ऊर्जाप्रतिमानस्य अन्वेषणं उपअनुकूलस्थलात् आरसीपर्यन्तं प्रत्यक्ष ऊर्जास्थापनात् द्रुततरं न भवति। RC-LH114-W इत्यस्मिन् खुले-पाशः LH1 पाशः संरचनात्मकविश्लेषणार्थं न्यूनतापमानस्य परिस्थितौ अपि तुच्छतापगतिः भवितुं शक्नोति, तथा च RC 1 इत्यस्य स्थाने βBChls इत्यस्य रञ्जनदूरात् कक्षतापमाने दीर्घतरं αβ14 रिंगसंरचना भवति
आरसी-एलएच११६ परिसरे ३२ बीसीएच्ल्स तथा १६ कैरोटीनोइड्स् सन्ति, तस्य समग्रव्यवस्था थर्मोक्रोमैटियम (Tch.) पिड्पिडम [प्रोटीन डाटा बैंक (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 तनाव ( PDB ID 7C9R) (12) तथा हरितवर्णात् प्राप्ता एव अस्ति शैवाल (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10)। संरेखणानन्तरं αβ विषमयुग्मकानां स्थानेषु केवलं लघुविचलनानि अवलोकितानि, विशेषतः १-५, १५, १६ च (चित्रम् S6) । प्रोटीन-डब्ल्यू इत्यस्य उपस्थित्या LH1 इत्यस्य संरचनायां महत्त्वपूर्णः प्रभावः भवति । अस्य त्रयः TMH लघुपाशैः सम्बद्धाः सन्ति, यत्र N-अन्तभागः परिसरस्य लुमेनपक्षे, C-अन्तः कोशिकाद्रव्यपक्षे च भवति (चित्रम् १A तथा ३, A तः D) प्रोटीन-W बहुधा जलघोषकं भवति (चित्रम् ३ बी), तथा च TMH2 तथा TMH3 LH1αβ-14 इत्यनेन सह अन्तरक्रियां कृत्वा झिल्लीपारपृष्ठं निर्मान्ति (चित्रम् ३, बी तथा ई तः जी पर्यन्तम्) अन्तरफलकं मुख्यतया झिल्लीपारप्रदेशे Phe, Leu, Val अवशेषैः निर्मितं भवति । एते अवशेषाः जलघोषक-अमीनो अम्लैः, αβ-14 वर्णकैः च स्तम्भिताः भवन्ति । केचन ध्रुवीय अवशेषाः अपि अन्तरक्रियायां योगदानं ददति, यत्र जटिलगुहाया: पृष्ठे W-Thr68 तथा β-Trp42 इत्येतयोः मध्ये हाइड्रोजनबन्धः अपि अस्ति (चित्रम् ३, F तथा G) कोशिकाद्रव्यस्य पृष्ठभागे Gln34 αβ-14 कैरोटीनोइड्-समूहस्य कीटो-समूहस्य समीपे भवति । तदतिरिक्तं, n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) अणुः निराकृतः, तस्य जलभक्षकपुच्छः प्रोटीन-W तथा αβ-14 इत्येतयोः मध्ये अन्तरफलकं यावत् विस्तारितः, तथा च लिपिडपुच्छः शरीरे स्थितः भवितुम् अर्हति अस्माभिः इदमपि अवलोकितं यत् प्रोटीन W तथा RCH इत्येतयोः C-अन्तसंकल्पप्रदेशाः अतीव समीपस्थाः सन्ति, परन्तु विशिष्टपरस्परक्रियाणां निर्माणस्य व्याप्तेः अन्तः न सन्ति (चित्रम् १, ए, ई च) परन्तु एतयोः प्रोटीनयोः असमाधानीय-सी-अन्त-अमीनो-अम्लयोः अन्तरक्रियाः भवितुम् अर्हन्ति, ये आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू-सङ्कुलस्य संयोजनस्य समये प्रोटीन-डब्ल्यू-नियुक्त्यर्थं तन्त्रं प्रदातुं शक्नुवन्ति
(A) प्रोटीन-W, यः कार्टुन्रूपेण LH1αβ14 इत्यनेन सह अन्तरफलकस्य सम्मुखं भवति, तस्य दण्डाकारस्य पार्श्वशृङ्खला (लालः) भवति, यः विद्युत्स्थैतिकविभवचित्रस्य (0.13 समोच्चस्तरयुक्तः पारदर्शी धूसरपृष्ठः) एकस्मिन् भागे प्रदर्शितः अस्ति (B) जलघोषकवर्णीयपृष्ठेन प्रतिनिधितः प्रोटीन-W। ध्रुवीयक्षेत्राणि आभारयुक्तानि च क्षेत्राणि सियानरूपेण, जलघोषकक्षेत्राणि श्वेतवर्णेन, प्रबलजलघोषकक्षेत्राणि च नारङ्गवर्णेन प्रदर्शितानि सन्ति । (C and D) कार्टुन् मध्ये प्रतिनिधित्वं कृतं प्रोटीन-W, तस्य अभिमुखीकरणं (A) (C) इत्यस्य समानं भवति, तथा च 180° (D) द्वारा परिभ्रमितम् अस्ति । क्रमे स्थितानुसारं भेदयोग्याः अवशेषाः इन्द्रधनुषवर्णयोजनां स्वीकुर्वन्ति, यत्र N-अन्तं नीलवर्णं, C-अन्तं रक्तं च भवति (E) प्रोटीन-W (A) इत्यस्य समानदृश्ये, प्रोटीन-W:LH1 इत्यस्य अन्तरफलके अवशेषाः च संलग्नचिह्नयुक्तैः दण्डैः प्रतिनिधित्वं कुर्वन्ति । (F) प्रोटीन-W कार्टुन् प्रतिनिधित्वे (E) तथा LH1αβ14 इत्येतयोः सापेक्षं 90° परिभ्रमति, तथा च बार प्रतिनिधित्वे अन्तरफलकावशेषाणां सापेक्षम्। बीटा-पॉलीपेप्टाइड्-तः अतिलम्बित-अवशेषाः लेबलं भवन्ति । सहकारकः चित्रस्य १ वर्णेन सह मेलरूपेण पट्टिकारूपेण दर्शितः, विघटितः β-DDM धूसरवर्णेन दर्शितः, आक्सीजनः च रक्तवर्णेन दर्शितः (G) (F) इत्यस्मिन् दृश्यं १८०° परिभ्रमितं भवति, यत्र लेबलयुक्तस्य आल्फा-पॉलीपेप्टाइडस्य प्रमुखाः अवशेषाः सन्ति ।
प्रोटीन-W एकस्य αβ विषमयुग्मकस्य (चित्रे 1F मध्ये 15तमस्य) स्थाने भवति, तस्मात् लूपसमापनं निवारयति तथा च प्रथमत्रिषु αβ विषमयुग्मनेषु झुकावः भवति अवलोकितं यत् प्रथमस्य αβ-1 हेटरोडाइमरस्य अधिकतमः झुकावकोणः चलचित्रसामान्यस्य सापेक्षः २५° तः २९° (चित्रम् १, ए तथा ई) आसीत्, यत् आरसी ए तीक्ष्णविपरीतता-एलएच११६ (चित्रम् १, बी तथा एफ) इत्यस्मिन् αβ-१ इत्यस्य २° तः ८° पर्यन्तं झुकावेन निर्मितम् आसीत् द्वितीयः तृतीयः च विषमयुग्मः क्रमशः १२° तः २२° पर्यन्तं ५° तः १०° पर्यन्तं च प्रवणः भवति । आरसी इत्यस्य स्टेरिकबाधायाः कारणात् αβ-1 इत्यस्य झुकावः αβ इत्यस्य द्वितीययुग्मं (यत् चित्रे 1F मध्ये 16 तमे αβ इत्यस्य अनुरूपं भवति) न समावेशयति, अतः LH1 रङ्गस्य स्पष्टं अन्तरं भवति (चित्रं 1, A तथा E) चतुर्णां BChl-द्वयोः कैरोटीनोइड्-हानिसहितं द्वयोः αβ-विषम-डाइमरयोः अभावात्, कश्चन अपि कैरोटीनोइड्-इत्येतत् मुड़ित-αβ-1-उप-एककेन सह न बन्धयति, यस्य परिणामेण १३ कैरोटीनोइड्-शाकाहारी-२८ BChls-युक्ताः LH114-W-वलयः भवति αβ1 तः 7 पर्यन्तं क्षेत्रेषु द्वयोः परिसरयोः स्थानीयसंकल्पानुमानं शेष LH1 लूपस्य अपेक्षया न्यूनं भवति, यत् RC QB साइट्-समीपस्थस्य LH1 उप-एककस्य निहित-प्लास्टिसिटीं प्रतिबिम्बयितुं शक्नोति (चित्रम् 4)
RC-LH114-W (A and B) तथा RC-LH116 (C and D) इत्येतयोः चित्राणि चित्र 1. (B and D) इत्यस्य समानं शीर्षदृश्यात्/पार्श्वदृश्यात् (A and B) (A and C) तथा गुहापृष्ठात् दर्शितानि सन्ति। वर्णयुक्तानि कीलानि दक्षिणतः दर्शितानि सन्ति ।
१:१४ स्टोइकियोमेट्रिक अनुपातयुक्तः एकमात्रः अन्यः लक्षणीयः कोरसङ्कुलः रोडोकोकस स्फेरोइड्स् (Rba.) RC-LH1-PufX डाइमर (13) अस्ति । परन्तु प्रोटीन W तथा PufX इत्येतयोः स्पष्टसमरूपता नास्ति, तथा च तेषां स्वस्व LH1 संरचनासु महत्त्वपूर्णः प्रभावः भवति । PufX एकः एकः TMH अस्ति यस्य N-अन्तीयकोशिकाद्रव्यक्षेत्रं भवति यत् Rps इत्यस्य अनुरूपस्थाने RC-H उप-एककस्य (13) कोशिकाद्रव्यपक्षेण सह अन्तरक्रियां करोति palustris LH116αβ-16. PufX RC-LH1 तथा साइटोक्रोम bcl परिसरस्य मध्ये क्विनोन्/क्विनोलोन् आदानप्रदानस्य कृते एकं चैनलं निर्माति तथा च सर्वेषु Rba मध्ये वर्तते । sphaeroides कोर परिसर (13)। यद्यपि एकल-एकल-अन्तरफलकं Rba मध्ये अस्ति । स्फेरोइड्स् RC-LH1-PufX डाइमर RC-LH114-W इत्यस्मिन् प्रोटीन W इत्यस्य बन्धनस्थाने स्थितः भवति, तथा च PufX तथा प्रोटीन-W इत्यनेन प्रेरितः अन्तरः समतुल्यस्थाने भवति (चित्रम् S7A) RC-LH114-W इत्यस्मिन् अन्तरं स्यूडोमोनास् रोसिया LH1 इत्यस्य काल्पनिकक्विनोन् चैनलेन (8) इत्यनेन सह अपि संरेखितम् अस्ति, यत् प्रोटीन W अथवा PufX इत्यनेन सह न सम्बद्धैः पेप्टाइडैः निर्मितं भवति (चित्रम् S7B) तदतिरिक्तं Blc. एकं γ उप-एककं (7) बहिष्कृत्य निर्मितं पन्ना-हरिद्रा LH1 समानस्थाने स्थितम् अस्ति (चित्रम् S7C) । यद्यपि भिन्नप्रोटीनद्वारा मध्यस्थता भवति तथापि आरसी-एलएच१ परिसरे सामान्यस्थाने एतेषां क्विनोन्/क्विनोलोल् चैनलानां उपस्थितिः अभिसरणविकासस्य उदाहरणं प्रतीयते, यत् सूचयति यत् प्रोटीन डब्ल्यू द्वारा निर्मितः अन्तरः क्विनोन् चैनलरूपेण कार्यं कर्तुं शक्नोति
LH114-W पाशस्य अन्तरं प्रोटीनेषु इव प्रोटीनछिद्रद्वारा डोमेनद्वयं संयोजयितुं न अपितु RC-LH114-W परिसरस्य आन्तरिकस्थानस्य बल्कझिल्लीयाश्च मध्ये निरन्तरझिल्लीप्रदेशस्य निर्माणस्य अनुमतिं ददाति RC-LH116 परिसरः बन्द Tch इत्यस्य सदृशः अस्ति । सुई-सदृश परिसर (22) (चित्र 1H)। यतो हि झिल्लीद्वारा क्विनोनस्य प्रसारः संकीर्णप्रोटीनचैनलद्वारा प्रसारणात् द्रुततरः भवति, मुक्त LH114-W पाशः बन्द LH116 पाशस्य अपेक्षया द्रुततरं RC-परिवर्तनं अनुमन्यते, आरसी-मध्ये क्विनोनस्य प्रसारः अधिकं प्रतिबन्धितः भवितुम् अर्हति प्रोटीन डब्ल्यू आरसी मार्गेण क्विनोनस्य परिवर्तनं प्रभावितं करोति वा इति परीक्षणार्थं वयं यूबिक्विनोन 2 (UQ2) (लघुतर आइसोप्रीनपुच्छयुक्त प्राकृतिक UQ10 इत्यस्य एनालॉग्) इत्यस्य निश्चितसान्द्रतायाः उपरि साइटोक्रोम आक्सीकरणपरीक्षणं कृतवन्तः (चित्रम् 2E)। यद्यपि किलेटेड क्विनोनस्य उपस्थितिः स्पष्टस्य माइकेलिस् स्थिरांकस्य सटीकनिर्धारणे बाधां जनयति (RC-LH114-W तथा RC-LH116 क्रमशः 0.2±0.1μM तथा 0.5±0.2μM कृते उपयुक्ताः सन्ति), तथापि RC-LH114-W ( 4.6±0.2 e-RC-1 s-1) इत्यस्य अधिकतमं दरं भवति आरसी-एलएच११६ (३.६±०.१ ई-आरसी-१ एस-१) इत्यस्मात् २८±५% बृहत् ।
अस्माभिः प्रारम्भे अनुमानितम् यत् प्रोटीन-डब्ल्यू कोर-सङ्कुलस्य प्रायः १०% भागे वर्तते (१६); अत्र न्यूनप्रकाशस्य, मध्यमप्रकाशस्य, उच्चप्रकाशस्य च वृद्धिकोशिकानां कब्जादराः क्रमशः १५±०.६%, ११±१%, ०.९±०.५ च सन्ति (चित्रम् २F) द्रव्यमानवर्णक्रममापनस्य परिमाणात्मकतुलनायां ज्ञातं यत् हिस्टिडिनटैगस्य योजनेन वन्यप्रकारस्य उपभेदानाम् (P = 0.59) तुलने प्रोटीन-डब्ल्यू इत्यस्य सापेक्षिकप्रचुरतायां न्यूनता न अभवत्, अतः एते स्तराः परिवर्तितप्रोटीन-डब्ल्यू इत्यस्य कलाकृतिः न सन्ति (चित्रं S10) परन्तु आरसी-एलएच१ परिसरे प्रोटीन-डब्ल्यू इत्यस्य एषा न्यूनकब्जता केषाञ्चन आरसीनां त्वरितदरेण पलटितुं शक्नोति, येन आरसी-एलएच११६ परिसरे मन्दतरं क्विनोन्/क्विनोलोन् आदानप्रदानं न्यूनीकरोति अस्माभिः अवलोकितं यत् उच्चप्रकाश-अधिग्रहण-दरः अद्यतन-ट्रांसक्रिप्टोमिक्स-दत्तांशैः सह असङ्गतः अस्ति, यत् सूचयति यत् pufW जीन-अभिव्यक्तिः प्रबल-प्रकाशस्य अधीनं वर्धते (चित्रम् S11) (23) RC-LH1 परिसरे pufW प्रतिलेखनस्य प्रोटीन-W समावेशस्य च मध्ये अन्तरं भ्रान्तिकं भवति तथा च प्रोटीनस्य जटिलविनियमनं प्रतिबिम्बयितुं शक्नोति
RC-LH114-W इत्यस्मिन् 6 कार्डियोलिपिन् (CDL), 7 फॉस्फेटिडाइलकोलाइन (POPC), 1 फॉस्फेटिडाइलग्लिसरॉल (POPG) तथा 29 β-DDM अणुः आवंटिताः भवन्ति तथा च तस्मिन् 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs तथा 12 βDDMs इत्यस्य मॉडलिंगं भवति RC-LH116 (चित्र 5, क तथा ख)। एतयोः संरचनायोः सीडीएल प्रायः परिसरस्य कोशिकाद्रव्यपक्षे स्थितः भवति, यदा तु पीओपीसी, पीओपीजी, बीटा-डीडीएम च अधिकतया लुमिनलपक्षे स्थिताः भवन्ति RC-LH114-W परिसरस्य αβ-1 तः αβ-6 पर्यन्तं द्वौ लिपिड् अणुः पृथक्कृतौ (चित्रम् 5A), पञ्च च RC-LH116 इत्यस्य समतुल्यक्षेत्रे पृथक्कृतौ (चित्रम् 5B) परिसरस्य परे पार्श्वे अधिकानि लिपिड्-आदीनि प्राप्तानि, मुख्यतया सीडीएल, आरसी तथा αβ-7 तः αβ-13 पर्यन्तं सञ्चितानि (चित्रम् ५, ए, बी) । अन्ये संरचनात्मकरूपेण समाधानं प्राप्ताः लिपिडाः डिटर्जन्टाः च LH1 वलयस्य बहिः स्थिताः सन्ति, तथा च सुसमाधानं प्राप्ताः एसिल् श्रृङ्खलाः LH1 उप-इकायानां मध्ये विस्तारिताः सन्ति, ये अस्थायीरूपेण RC-LH114-W इत्यस्मिन् β-DDM इति निर्दिष्टाः, आरसी A β-DDM तथा POPC-LH116 इत्यस्य मिश्रणे β-DDM इति परिभाषिताः सन्ति अस्माकं संरचनायां किलेटिङ्ग-लिपिड्स् तथा डिटर्जन्ट् इत्येतयोः समानस्थानानि सूचयन्ति यत् ते शारीरिकरूपेण प्रासंगिकाः बन्धनस्थलानि सन्ति (चित्रम् S12A) । Tch इत्यस्मिन् समतुल्य-अणुषु स्थानेषु अपि उत्तमं स्थिरता भवति । सौम्य तथा त्रव. तनाव 970 RC-LH1s (चित्र S12, B तः E) (9, 12) तथा लिपिड-शिरः समूहस्य हाइड्रोजन-बन्धन-अवशेषाः अनुक्रम-संरेखणे (चित्रं S13) तुल्यरूपेण उत्तमं संरक्षणं दर्शितवन्तः, यत् सूचयति यत् संरक्षितः CDL यः RC (24) सह बन्धनं करोति, एते स्थलानि RC-LH1 परिसरे संरक्षितानि भवितुम् अर्हन्ति
(A and B) RC-LH114-W (A) तथा RC-LH116 (B) पेप्टाइड्-इत्येतत् कार्टुन्-द्वारा दर्शितं भवति, तथा च वर्णकं चित्रे 1 मध्ये वर्ण-योजनायाः उपयोगेन दण्डैः दर्शितं भवति ।लिपिडाः रक्तवर्णेन दर्शिताः सन्ति, डिटर्जन्टाः च ग्रे-वर्णेन दर्शिताः सन्ति आरसी क्यूए तथा क्यूबी स्थलेषु बद्धः यूक्यू पीतः भवति, यदा तु पृथक्कृतः यूक्यू नीलवर्णः भवति । (C and D) (A) तथा (B) इव दृश्यानि, लिपिड् लोपिताः। (E to G) RC-LH116 तः Q1(E), Q2(F) तथा Q3(G) इत्येतयोः विस्तारितं दृश्यं, यत्र पार्श्वशृङ्खलाः परस्परं प्रभाविताः भवन्ति । जलवायुबन्धाः कृष्णा विच्छिन्नरेखारूपेण दर्शिताः सन्ति ।
RC-LH116 इत्यस्मिन् RC QA तथा QB UQ इत्येतयोः द्वयोः अपि, ये आभारपृथक्करणप्रक्रियायां इलेक्ट्रॉनस्थापने भागं गृह्णन्ति, तेषां बन्धनस्थलेषु विघटिताः भवन्ति परन्तु RC-LH114-W इत्यस्मिन् QB quinone इत्यस्य समाधानं न कृतम् अस्ति, तस्य विस्तरेण अधः चर्चा भविष्यति । QA तथा QB क्विनोनस्य अतिरिक्तं, द्वौ किलेटेड् UQ अणुौ (RC तथा LH1 रिंगयोः मध्ये स्थितौ) RC-LH114-W संरचनायां तेषां सुसमाधानितशिरःसमूहानां (क्रमशः Q1 तथा Q2 इत्यत्र स्थितानां) अनुसारं आवंटितौ भवतः स्थानं)। चित्रम् ५ ग)। Q1 कृते द्वौ आइसोप्रीन-एककौ नियुक्तौ स्तः, घनत्व-नक्शे च Q2 इत्यस्य सम्पूर्ण-10 आइसोप्रीन-पुच्छस्य समाधानं करोति । RC-LH116 इत्यस्य संरचनायां त्रयः किलेटेड् UQ10 अणुः (Q1 तः Q3 पर्यन्तं, चित्रं 5D) समाधानं प्राप्तवन्तः, तथा च सर्वेषां अणुनां सम्पूर्णे पुच्छे स्पष्टघनत्वं भवति (चित्रम् 5, D तः G) संरचनाद्वये Q1 तथा Q2 इत्येतयोः क्विनोनशिरःसमूहयोः स्थानेषु उत्तमः स्थिरता भवति (चित्रम् S12F), ते केवलं RC इत्यनेन सह अन्तरक्रियां कुर्वन्ति Q1 RC-LH114-W (चित्र 1G तथा 5, C, D तथा E) इत्यस्य W अन्तरालस्य प्रवेशद्वारे स्थितः अस्ति, तथा च Q2 QB बन्धनस्थलस्य (चित्र 5, C, D) तथा F) इत्यस्य समीपे स्थितः अस्ति संरक्षिताः L-Trp143 तथा L-Trp269 अवशेषाः Q1 तथा Q2 इत्येतयोः अत्यन्तं समीपे सन्ति तथा च सम्भाव्य π-स्टैकिंग अन्तरक्रियाः प्रदास्यन्ति (चित्रम् 5, E तथा F, तथा चित्रं S12)। Q1 इत्यस्य दूरस्थ-आक्सीजनात् 3.0 Å दूरे स्थितः L-Gln88, एकं दृढं हाइड्रोजन-बन्धं प्रदाति (चित्रम् 5E); अयं अवशेषः अत्यन्तं दूरस्थं सम्बन्धं विहाय सर्वेषु आरसीषु संरक्षितः भवति (चित्रम् S13) । L-Ser91 अन्येषु अधिकांशेषु RCs (चित्रं S13) Thr इत्यस्य रूढिवादीरूपेण प्रतिस्थापितं भवति, Q1 इत्यस्य मिथाइल-आक्सीजनतः 3.8 Angstroms अस्ति, तथा च दुर्बल-हाइड्रोजन-बन्धनं प्रदातुं शक्नोति (चित्र 5E) Q3 इत्यस्य विशिष्टः अन्तरक्रियाः न प्रतीयते, परन्तु RC-M उप-एककस्य LH1-α उप-एककस्य च 5 तः 6 पर्यन्तं जलभय-क्षेत्रे स्थितः अस्ति (चित्रम् 5, D तथा G) Q1, Q2 तथा Q3 अथवा समीपस्थं किलेटेड् क्विनोन्स् अपि Tch. सौम्य, त्रव. तनाव ९७० तथा Blc. परितारिकासंरचना (9, 10, 12) आरसी-एलएच1 परिसरे संरक्षितसहायकक्विनोनबन्धनस्थलं प्रति सूचयति (चित्रम् S12G) । RC-LH116 इत्यस्मिन् पञ्च विघटित-UQ उच्च-प्रदर्शन-तरल-क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा निर्धारितस्य प्रत्येकस्य परिसरस्य 5.8±0.7 इत्यनेन सह उत्तम-सहमताः सन्ति, यदा तु RC-LH114-W इत्यस्मिन् त्रयः विघटिताः UQs इत्यस्मात् न्यूनाः सन्ति The measured value of 6.2±0.3 (Fig. S14) indicates that there are unresolved UQs molecules.
छद्म-सममित L तथा M बहुपेप्टाइड्-मध्ये प्रत्येकं पञ्च TMHs भवन्ति तथा च एकं विषम-डाइमरं निर्मान्ति यत् एकं BChl डाइमरं, द्वौ BChl मोनोमरौ, द्वौ बैक्टीरियोफेज (BPh) मोनोमरौ, एकं गैर- हीम लोहं च एकं वा द्वौ वा UQ10 अणुः च संयोजयति अन्तीयकीटोनसमूहे हाइड्रोजनबन्धानां उपस्थित्या आरपीएस-मध्ये तस्य ज्ञातसञ्चयस्य माध्यमेन च कैरोटीनोइड्-इत्येतत् M-उप-एकके समावेशितं भवति, यस्य नाम cis-3,4-dehydroorhodopin इति भवति जाति (25) । आरसी-एच् इत्यस्य बाह्यझिल्लीक्षेत्रं एकेन टीएमएच् इत्यनेन झिल्लीयां लंगरितम् अस्ति । समग्रं आरसी संरचना सम्बन्धितजातीनां (यथा Rba) त्रयाणां उप-एककानाम् आरसी-सदृशी अस्ति । स्फेरोइड्स (PDB ID: 3I4D)। BChl तथा BPh इत्येतयोः स्थूलचक्राः, कैरोटीनॉयड् मेरुदण्डः, गैर-हीम लोहः च एतेषां संरचनानां रिजोल्यूशनपरिधिमध्ये ओवरलैप् भवन्ति, यथा QA स्थले UQ10 शिरः समूहः तथा RC-LH116 इत्यत्र QB क्विनोन् (चित्रं S15)
भिन्न-भिन्न-क्यूबी-स्थल-कब्ज-दर-युक्तयोः आरसी-संरचनानां उपलब्धता क्यूबी-क्विनोन-बन्धन-सहितं सुसंगत-संरचनात्मक-परिवर्तनानां परीक्षणस्य नूतनं अवसरं प्रदाति आरसी-एलएच११६ परिसरे क्यूबी क्विनोन् पूर्णतया बद्धे “प्रोक्सिमल” स्थाने (२६) स्थितः भवति, परन्तु आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू इत्यस्य पृथक्करणे क्यूबी क्विनोन् नास्ति RC-LH114-W इत्यस्मिन् QB क्विनोन् नास्ति, यत् आश्चर्यं यतः परिसरः सक्रियः अस्ति, संरचनात्मकरूपेण समाधानं प्राप्तस्य QB quinone युक्तस्य RC-LH116 परिसरस्य अपेक्षया अधिकं यद्यपि LH1 वलयद्वयं प्रायः षट् क्विनोन्स् किलेट् भवति तथापि बन्दे RC-LH116 रिंगमध्ये पञ्च संरचनात्मकरूपेण समाधानं प्राप्नुवन्ति, यदा तु मुक्त RC-LH114-W वलयस्य संरचनात्मकरूपेण केवलं त्रयः एव सीमिताः सन्ति एषः वर्धितः संरचनात्मकविकारः RC-LH114-W QB साइट्-स्थलानां द्रुततरं प्रतिस्थापनं, परिसरे द्रुततरं क्विनोन-गतिविज्ञानं, LH1-पाशं पारयितुं वर्धितां सम्भावनां च प्रतिबिम्बयितुं शक्नोति वयं सुचयामः यत् RC-LH114-W इत्यस्य RC QB साइट् इत्यस्मिन् UQ इत्यस्य अभावः अधिकजटिलस्य अधिकसक्रियस्य च परिसरस्य परिणामः भवितुम् अर्हति, तथा च RC-LH114-W इत्यस्य QB साइट् UQ कारोबारे तत्क्षणमेव जमितम् अस्ति विशिष्टः चरणः (QB साइट् इत्यस्य प्रवेशद्वारं बन्दं कृतम् अस्ति) अस्याः क्रियाकलापस्य संरचनां प्रतिबिम्बयति।
QB विना L-Phe217 इत्यस्य सहवर्ती परिभ्रमणं UQ10 बन्धनेन सह असङ्गतं स्थानं प्रति, यतः तत् पुच्छस्य प्रथमेन आइसोप्रीन-एककेन सह स्थानिक-टकरावं जनयिष्यति (चित्रम् 6A) तदतिरिक्तं, स्पष्टाः मुख्याः संरचनात्मकाः परिवर्तनाः स्पष्टाः सन्ति, विशेषतः हेलिक्स डी (TMH D तथा E इत्येतयोः मध्ये लूप् मध्ये लघु हेलिक्स) यत्र L-Phe217 QB बन्धनजेबं प्रति स्थानान्तरितम् अस्ति तथा च L-Tyr223 (चित्र 6A ) M-Asp45 ढाञ्चेन सह हाइड्रोजनबन्धं भङ्गयितुं QB बन्धनस्थलस्य प्रवेशद्वारं बन्दं कर्तुं च (चित्रम् ६ ख) । हेलिक्सः स्वस्य आधारे डी पिवट् भवति, L-Ser209 इत्यस्य Cα 0.33Å इत्यनेन स्थानान्तरितः भवति, यदा तु L-Val221Cα 3.52Å इत्यनेन स्थानान्तरितः भवति । TMH D तथा E इत्येतयोः मध्ये कोऽपि अवलोकनीयः परिवर्तनः नास्ति, ये उभयसंरचनासु सुपरइम्पोजेबलाः सन्ति (चित्रम् 6A) । यावत् वयं जानीमः, प्राकृतिक-आरसी-मध्ये एषा प्रथमा संरचना अस्ति या क्यूबी-स्थलं बन्दं करोति । पूर्ण (QB-बद्ध) संरचनायाः सह तुलना दर्शयति यत् क्विनोनस्य न्यूनीकरणात् पूर्वं क्विनोन् मध्ये प्रवेशं कर्तुं संरचनात्मकपरिवर्तनस्य आवश्यकता भवति L-Phe217 क्विनोन-शिरः-समूहेन सह π-स्टैकिंग-अन्तर्क्रियाम् निर्मातुं परिभ्रमति, तथा च हेलिक्सः बहिः स्थानान्तरं करोति, येन L-Gly222 इत्यस्य कंकालः L-Tyr223 इत्यस्य पार्श्वशृङ्खला च स्थिर-हाइड्रोजन-बन्धन-संरचनायाः सह हाइड्रोजन-बन्ध-जालं निर्मातुं शक्नोति (चित्रम् 6, A, C)
(A) होलोग्राम (L श्रृङ्खला, नारंगी/M श्रृङ्खला, मैजेन्टा) तथा एपो (धूसर) संरचनायाः ओवरलैपिंग कार्टुन्, यस्मिन् मुख्यावशेषाः दण्डसदृशप्रतिपादनस्य रूपेण प्रदर्शिताः भवन्ति। UQ10 पीतवर्णेन पट्टिकायाः ​​प्रतिनिधित्वं भवति । बिन्दुरेखा सम्पूर्णसंरचनायाः निर्मिताः जलवायुबन्धाः सूचयति । (B and C) एपोलिपोप्रोटीनस्य तथा सम्पूर्णवलयसंरचनायाः पृष्ठीयप्रतिनिधित्वं, क्रमशः L-Phe217 इत्यस्य पार्श्वशृङ्खला-आक्सीजनं नीलवर्णे तथा L-Tyr223 रक्तवर्णे प्रकाशयति। L उप-एककं नारङ्गवर्णीयं भवति; M तथा H उप-एककाः वर्णयुक्ताः न भवन्ति । (D and E) एपोलिपोप्रोटीन (D) तथा सम्पूर्ण (E) आरसी क्यूबी साइट्स [क्रमशः (A) द्वारा रङ्ग] तथा थर्मोफिलस थर्मोफिलस PSII (हरित, प्लास्टिक क्विनोन सह नीला; PDB ID: 3WU2) संरेखित करें (58)।
अप्रत्याशितरूपेण यद्यपि LH1 विना QB-अभावयुक्तानां RCs इत्यस्य अनेकाः संरचनाः उपलभ्यन्ते तथापि अस्मिन् अध्ययने अवलोकितानां संरचनापरिवर्तनानां पूर्वं सूचना न दत्ता अस्ति एतेषु Blc तः QB क्षयसंरचना अन्तर्भवति। viridis (पीडीबी आईडी: 3पीआरसी) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) तथा Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), ये सर्वे तेषां समग्र QB संरचनायाः प्रायः समानाः सन्ति । 3PRC इत्यस्य निकटनिरीक्षणेन ज्ञातं यत् LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) डिटर्जन्ट-अणुः QB-स्थानस्य प्रवेशद्वारे बन्धनं करोति, येन बन्द-संरचनायाः पुनर्व्यवस्थापनं निवारयितुं शक्यते यद्यपि 1EYS अथवा 1OGV इत्यस्मिन् LDAO समानस्थाने न विघट्यते तथापि एते RCs समाने डिटर्जन्टस्य उपयोगेन निर्मिताः भवन्ति अतः समानप्रभावं जनयितुं शक्नुवन्ति Rba इत्यस्य स्फटिकसंरचना । साइटोक्रोम c2 (PDB ID: 1L9B) इत्यनेन सह सह-स्फटिकीकृतः स्फेरोइड्स् आरसी इत्यस्य अपि बन्दं क्यूबी-स्थलं दृश्यते । तथापि, अस्मिन् सन्दर्भे आरसी-एम पॉलीपेप्टाइडस्य N-अन्तक्षेत्रं (Q हेलिक्स इत्यत्र Tyr अवशेषस्य H बन्धनस्य माध्यमेन QB बन्धनस्थलेन सह अन्तरक्रियां कुर्वन्) अप्राकृतिकं संरचनां स्वीकुर्वति, तथा च QB संरचनापरिवर्तनस्य अग्रे अन्वेषणं न भवति (30) किं आश्वासनात्मकं यत् अस्माभिः RC-LH114-W संरचनायां M polypeptide इत्यस्य एतादृशं विरूपणं न दृष्टम्, यत् RC-LH116 RC इत्यस्य N-terminal region इत्यस्य प्रायः समानम् अस्ति इदमपि ज्ञातव्यं यत् डिटर्जन्ट-आधारितस्य LH1 एंटीनायाः उन्मूलनानन्तरं पीडीबी-मध्ये एपोलिपोप्रोटीन-आरसी-समाधानं जातम्, येन आरसी-परिसरस्य एलएच१-वलयस्य आन्तरिकपृष्ठयोः अन्तरालस्य आन्तरिक-क्विनोन्-कुण्डाः, लिपिडाः च समाप्ताः अभवन् (३१, ३२) आरसी कार्यात्मकः एव तिष्ठति यतोहि एतत् सर्वाणि सहकारकाणि धारयति, विघटनीयं क्यूबी क्विनोन् इत्येतत् विहाय, यत् न्यूनस्थिरं भवति तथा च प्रायः निर्माणप्रक्रियायाः समये नष्टं भवति (33) तदतिरिक्तं, एतत् ज्ञायते यत् आरसीतः LH1 तथा प्राकृतिकचक्रीयलिपिड्स् इत्यस्य निष्कासनेन कार्येषु प्रभावः भवितुम् अर्हति, यथा आभार-पृथक्कृतस्य P+QB-अवस्थायाः अल्पायुषः (31, 34, 35) अतः वयं अनुमानं कुर्मः यत् आरसी इत्यस्य परितः स्थानीयस्य LH1 रिंगस्य अस्तित्वं “बन्द” QB स्थलं निर्वाहयितुं शक्नोति, तस्मात् QB इत्यस्य समीपे स्थानीयवातावरणस्य संरक्षणं कर्तुं शक्नोति।
यद्यपि एपोलिपोप्रोटीन् (QB quinone विना) तथा सम्पूर्णसंरचना QB साइट् इत्यस्य कारोबारस्य केवलं द्वौ स्नैपशॉट् प्रतिनिधित्वं करोति, न तु घटनानां श्रृङ्खलायाम्, तथापि एतादृशाः संकेताः सन्ति यत् हाइड्रोक्विनोनेन पुनः बन्धनं निवारयितुं बन्धनं गेट् कर्तुं शक्यते To inhibit substrate inhibition. एपोलिपोप्रोटीनस्य क्यूबी-स्थलस्य समीपे क्विनोलोल्-क्विनोन्-योः परस्परक्रिया भिन्ना भवितुम् अर्हति, येन आरसी-द्वारा तस्य अस्वीकारः भवति । क्विनोनस्य बन्धने न्यूनीकरणे च संरचनापरिवर्तनस्य भूमिका भवति इति चिरकालात् प्रस्तावितं अस्ति । अन्धकार-अनुकूलनस्य अनन्तरं जमेन आरसी-समूहानां क्विनोन-कमीकरणस्य क्षमता बाधिता भवति (३६); एक्स-रे स्फटिकविज्ञानं दर्शयति यत् एतत् क्षतिः सक्रियसमीपस्थस्थानात् (26) , 37) प्रायः 4.5 Å दूरे “दूरस्थ” संरचनायां QB क्विनोन्स् फसितस्य कारणेन भवति वयं सुचयामः यत् एषा दूरस्थबन्धनसंरचना एपोलिपोप्रोटीनस्य पूर्णवलयसंरचनायाः च मध्ये मध्यवर्ती अवस्थायाः स्नैपशॉट् अस्ति, यत् क्विनोनेन सह प्रारम्भिकपरस्परक्रियायाः तथा क्यूबीस्थलस्य उद्घाटनस्य अनुसरणं करोति
कतिपय प्रकाशभक्षकजीवाणुनां तथा सियानोबैक्टीरिया, शैवाल तथा वनस्पतयः पीएसआईआई परिसरे दृश्यमानस्य द्वितीयप्रकारस्य आरसी संरचनात्मकं कार्यात्मकं च संरक्षणं भवति (38)। चित्रे 6 (D तथा E) दर्शितं संरचनात्मकं संरेखणं PSII RCs तथा जीवाणु RC परिसरस्य QB स्थलस्य समानतायाः उपरि बलं ददाति। इयं तुलना चिरकालात् क्विनोनबन्धनस्य न्यूनीकरणस्य च निकटसम्बद्धप्रणालीनां अध्ययनार्थं आदर्शः अस्ति । पूर्वप्रकाशनेषु सूचितं यत् संरचनात्मकपरिवर्तनानि क्विनोनस्य PSII न्यूनीकरणेन सह भवन्ति (39, 40) । अतः आरसी इत्यस्य विकासात्मकसंरक्षणं विचार्य पूर्वं अनवलोकितं एतत् बन्धनतन्त्रं आक्सीजनयुक्तेषु प्रकाशोत्पादकपौधेषु पीएसआईआई आरसी इत्यस्य क्यूबी स्थले अपि प्रयोज्यः भवितुम् अर्हति
Rps ΔpufW (अलेबल pufW विलोपन) तथा PufW-His (C-टर्मिनल 10x His-टैग्ड् प्रोटीन-W प्राकृतिक pufW लोकसतः व्यक्तम्) उपभेदाः। palustris CGA009 इत्यस्य वर्णनं अस्माकं पूर्वकार्य्ये (16) कृतम् आसीत् । एतेषां उपभेदानाम् अपि च समजननवन्यप्रकारस्य मातापितरं PYE (प्रत्येकं 5 g लीटर -1) (-80 °C इत्यत्र LB इत्यस्मिन् संगृहीतं, यस्मिन् 50% ( w/v) ग्लिसरॉल) प्रोटीन, खमीरस्य अर्कः, सुक्सिनेट् च भवति) अगर [1.5% (w/v)] प्लेट् इत्यत्र अल्पसंख्याकानां कोशिकानां रेखाकरणं कृत्वा फ्रीजर्तः पुनः प्राप्तः प्लेट् अवायुहीनस्थितौ कक्षतापमाने अन्धकारे रात्रौ यावत् इन्क्यूबेशनं कृतम्, ततः OSRAM 116-W हैलोजनबल्बैः (RS Components, UK) द्वारा प्रदत्तेन श्वेतप्रकाशेन (~50 μmolm-2 s-1) 3 तः 5 दिवसपर्यन्तं प्रकाशितं यावत् एकः उपनिवेशः न प्रादुर्भूतः 0.1% (w/v) कासामिनो अम्लैः (अतः M22 इति उच्यते) पूरितस्य 10 ml M22+ माध्यमस्य (41) टीकाकरणार्थं एकस्यैव उपनिवेशस्य उपयोगः कृतः संस्कृतिं न्यून-आक्सीजन-स्थितौ अन्धकारे ३४ डिग्री सेल्सियस-पर्यन्तं १८० आरपीएम-इत्यनेन ४८ घण्टापर्यन्तं कम्पयित्वा वर्धितम्, ततः ७० मिलीलीटर-संस्कृतेः समानपरिस्थितौ २४ ​​घण्टापर्यन्तं टीकाकरणं कृतम् 30 मिलीलीटरस्य सार्वभौमिक-स्क्रू-टॉप-पारदर्शी-काचस्य बोतले 30 मिलीलीटर-एम22-माध्यमस्य टीकाकरणाय 1 मिलीलीटर-आयतनयुक्तस्य अर्ध-वायुयुक्त-संस्कृतेः उपयोगः भवति तथा च बाँझ-चुम्बकीय-बलेन 48 घण्टापर्यन्तं हलचल-दण्डेन आन्दोलनेन (~50μmolm-2 s-1) विकिरणं क्रियते ततः ३० मिलीलीटरं संस्कृतिं प्रायः १ लीटरसंस्कृत्या सह समानेषु परिस्थितिषु टीकाकरणं कृतम्, यस्य उपयोगेन ~२०० μmolm-2 s-1 इत्यत्र प्रकाशितं प्रायः ९ लीटरं संस्कृतिं ७२ घण्टापर्यन्तं टीकाकरणं कृतम् कोशिकानां 7132 RCF इत्यत्र 30 मिनिट् यावत् अपकेन्द्रीकरणेन संग्रहणं कृतम्, ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) इत्यस्मिन् पुनः निलम्बितं, आवश्यकतापर्यन्तं -20°C इत्यत्र संगृहीतम्
पिघलनस्य अनन्तरं पुनः निलम्बितकोशिकासु डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियस् I (Merck, UK), लाइसोजाइम (Merck, UK) तथा च द्वौ रोचे होलोएन्जाइम प्रोटीज इन्हिबिटर गोल्यौ (Merck, UK) इत्यस्य केचन स्फटिकाः योजयन्तु २०,००० psi फ्रेंच-दाब-कोशिकायां (Aminco, USA) कोशिका ८ तः १२ वारं बाधिताः अभवन् । अखण्डकोशिकानां अघुलनशीलमलानां च 18,500 RCF इत्यत्र 4°C इत्यत्र 15 निमेषपर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणेन निष्कास्य, 113,000 RCF इत्यत्र 43,000°C इत्यत्र 2 घण्टापर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणेन रञ्जकयुक्तात् लाइसेट् इत्यस्मात् झिल्लीं अवक्षेपणं कृतम् घुलनशीलं अंशं परित्यज्य वर्णितझिल्लीं 100 तः 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) इत्यस्मिन् पुनः लम्बयित्वा यावत् दृश्यमानसमुच्चयः न भवन्ति तावत् समरूपं कुर्वन्तु। निलम्बितझिल्लीं 2% (w/v) β-DDM युक्ते 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) इत्यस्मिन् 4°C इत्यत्र अन्धकारे 1 घण्टां यावत् मन्दं हलचलं कृत्वा इन्क्यूबेट् कृतम् ततः 70°C मध्ये अपकेन्द्रीकरणं कृत्वा 150,000 RCF 4°C मध्ये 1 घण्टां यावत् विलयनं कृत्वा अवशिष्टं अघुलनशीलं दूरीकर्तुं शक्यते।
ΔpufW तनावात् घुलनशीलझिल्लीं 50 ml DEAE Sepharose आयनविनिमयस्तम्भे 0.03% (w / v) β-DDM युक्तस्य बन्धनबफरस्य त्रीणि स्तम्भमात्राभिः (CV) सह प्रयुक्ता [20 mM tris-HCl (pH 8.0) स्तम्भं द्वयोः CV बन्धनबफरयोः प्रक्षाल्य, ततः 50 mM NaCl युक्तयोः बन्धनबफरयोः सह स्तम्भं प्रक्षाल्यताम् । RC-LH116 परिसरं 1.75 CV इत्यत्र 150 तः 300 mM NaCl (बन्धनबफरमध्ये) रेखीयढालेन सह इल्युट् कृतम्, अवशिष्टं बन्धनसङ्कुलं 0.5 CV इत्यत्र 300 mM NaCl युक्तेन बन्धनबफरेन इल्युट् कृतम् २५० तः १००० एनएमपर्यन्तं अवशोषणवर्णक्रमं संग्रह्य, ८८० तः २८० एनएमपर्यन्तं १ तः अधिकशोषणानुपातयुक्तं अंशं (A880/A280) स्थापयित्वा, बन्धनबफरमध्ये द्विवारं पतला कृत्वा, शुद्धीकरणे DEAE स्तम्भे पुनः समानप्रक्रियायाः उपयोगं कुर्वन्तु १.७ तः अधिकस्य A880/A280 अनुपातस्य तथा 3.0 तः अधिकस्य A880/A805 अनुपातस्य अंशान् पतला कुर्वन्तु, आयनविनिमयस्य तृतीयपरिक्रमं कुर्वन्तु, तथा च A880/A280 अनुपातेन 2.2 तः अधिकं तथा A880/A805 अनुपातं 5.0 तः अधिकं युक्तान् अंशान् धारयन्तु आंशिकरूपेण शुद्धं परिसरं Amicon 100,000 आणविकभारकट-ऑफ (MWCO) केन्द्रापसारक-छिद्रे (Merck, UK) ~2 ml यावत् सान्द्रीकृतम्, तथा च 200 mM NaCl बफर युक्ते Superdex 200 16/600 आकार-बहिष्कार-स्तम्भे (GE Healthcare, US) लोड् कृतम्, ततः 1.5 CV इत्यत्र तस्मिन् एव बफर-मध्ये इल्यूट् कृतम् आकार-बहिष्कार-अंशस्य अवशोषण-वर्णक्रमं संग्रहयन्तु, तथा च A880/A280 अनुपातेन 2.4 तः 5.8 तः 100 A880 पर्यन्तं A880/A805 अनुपातेन सह अवशोषण-वर्णक्रमं केन्द्रीकृत्य, तत्क्षणमेव क्रायो-TEM-जाल-निर्माणार्थं वा भण्डारणार्थं वा तेषां उपयोगं कुर्वन्तु आवश्यकतापर्यन्तं -80°C-पर्यन्तं स्थापयन्तु
PufW-His तनावात् घुलनशीलझिल्लीं IMAC बफर ( GE Healthcare) इत्यस्मिन् 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose स्तम्भे (20 mM tris-HCl (pH 8.0) यस्मिन् 200 mM NaCl तथा 0.03% (w/w)) युक्ते प्रयुक्ता आसीत् v) β-डीडीएम]। स्तम्भं पञ्चभिः IMAC बफरेन प्रक्षालितम्, ततः 10 mM हिस्टिडिन् युक्तस्य IMAC बफरस्य पञ्च CVs इत्यनेन प्रक्षालितम् । कोर परिसरं स्तम्भात् पञ्चभिः IMAC बफरैः सह 100 mM हिस्टिडिन् युक्तैः इल्युट् कृतम् । RC-LH114-W परिसरं युक्तं अंशं Amicon 100,000 MWCO फ़िल्टर (Merck, UK) इत्यनेन सुसज्जिते हलचलितटङ्के ~10 ml यावत् सान्द्रीकृत्य, बाइण्डिंग बफरेन 20 वारं पतला क्रियते, ततः 25 ml यावत् योजितं भवति DEAE Sepharose स्तम्भे बफरेन सह बद्धानां चत्वारि CVs पूर्वमेव उपयुज्यन्ते स्तम्भं चतुर्भिः CV बन्धनबफरैः प्रक्षाल्य, ततः 0 तः 100 mM NaCl (बन्धनबफरमध्ये) रेखीयप्रवणतायां अष्टसु CVs इत्यत्र परिसरं इल्युट् कुर्वन्तु, शेषचतुर्णां CVs 100 mM बन्धनबफरयुक्तानि च अवशिष्टसंकुलाः 2.4 तः अधिकेन A880/A280 अनुपातेन सह मिलित्वा सोडियमक्लोराइडे इल्युट् कृतवन्तः तथा च 4.6 अंशात् अधिकं A880/A805 अनुपातं Amicon 100,000 MWCO केन्द्रापसारक-छिद्रे ~2 ml यावत् सान्द्रीकृतम्, तथा च 1.5 CV IMAC इत्यनेन पूर्वमेव पूरितं Buffer equilibrated Superdex 200 16/600 आकार-बहिष्कार-स्तम्भे, ततः 1.5 CV-पर्यन्तं समाने बफर-मध्ये इल्यूट् कृतम् आकार-बहिष्कार-अंशानां अवशोषण-वर्णक्रमं संग्रहयन्तु तथा च A880/A280 अनुपातेन 2.1 तः अधिकं A880/A805 अनुपातेन सह अवशोषण-स्पेक्ट्रां केन्द्रीकृत्य 4.6 तः 100 A880 पर्यन्तं A880/A805 अनुपातेन सह एकाग्रं कुर्वन्तु, येषां उपयोगः तत्क्षणं जमेन TEM जाल-निर्माणार्थं भवति अथवा आवश्यकतापर्यन्तं -80°C इत्यत्र संगृहीतं भवति
न्यूनतापमानस्य TEM जालस्य निर्माणार्थं Leica EM GP विसर्जन फ्रीजरस्य उपयोगः कृतः । परिसरं IMAC बफरमध्ये 50 इत्यस्य A880 यावत् पतलं कृतम्, ततः 5μl नवगलो-निर्वाहित-QUANTIFOIL 1.2/1.3 कार्बन-लेपित-ताम्र-जालस्य (Agar Scientific, UK) इत्यत्र लोड् कृतम् जालम् २०°C तथा ६०% सापेक्षिक आर्द्रतायां ३० s यावत् इन्क्यूबेट् कुर्वन्तु, ततः ३ s यावत् शुष्कं कुर्वन्तु, ततः -१७६°C इत्यत्र द्रव-इथेन इत्यत्र शमनं कुर्वन्तु ।
RC-LH114-W परिसरस्य आँकडा: eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) इत्यत्र Titan Krios सूक्ष्मदर्शकेन सह अभिलेखिता:, यत् 300kV इत्यस्य त्वरकवोल्टेजेन कार्यं करोति, यस्य नाममात्रस्य आवर्धनं 130,000× भवति तथा च ऊर्जा- 20 eV इत्यस्य अन्तरं चिनुत आँकडानां संग्रहणार्थं गणनाविधाने चित्राणि अभिलेखयितुं K2 शिखरविज्ञापकयुक्तस्य Gatan 968 GIF Quantum इत्यस्य उपयोगः कृतः । मापितपिक्सेल-आकारः १.०४८Å, मात्रा-दरः ३.८३ e-Å-2s-१ च अस्ति । ११ सेकेण्ड् मध्ये चलचित्रं संगृह्य ४० भागेषु विभक्तवान् । सूक्ष्मदर्शकस्य पुनः केन्द्रीकरणाय कार्बन-लेपितक्षेत्रस्य उपयोगं कुर्वन्तु, ततः प्रतिच्छिद्रं त्रीणि चलच्चित्राणि संग्रहयन्तु । कुलतः ३१३० चलच्चित्राणि एकत्रितानि, यत्र -१ तः -३μm पर्यन्तं विकेन्द्रीकरणमूल्यानि आसन् ।
आरसी-एलएच११६ परिसरस्य आँकडा एस्टरबरी जैवसंरचना प्रयोगशाला (लीड्स् विश्वविद्यालयः, यूके) इत्यत्र समानसूक्ष्मदर्शिकायाः ​​उपयोगेन एकत्रितः । १३० के आवर्धनेन गणनाविधाने आँकडानां संग्रहः कृतः, पिक्सेल-आकारः ४.६ ई-Å-२s-१ इत्यस्य मात्रायाः सह १.०६५ Å यावत् मापनं कृतम् । १२ सेकेण्ड् मध्ये अस्य चलच्चित्रस्य रिकार्ड् कृत्वा ४८ भागेषु विभक्तम् । कुलतः ३३५९ चलच्चित्राणि एकत्रितानि, यत्र -१ तः -३μm पर्यन्तं विकेन्द्रीकरणमूल्यानि आसन् ।
सर्वं दत्तांशसंसाधनं Relion 3.0 पाइप्लाइन् (42) इत्यत्र क्रियते । खुराकभारद्वारा बीमगतिं सम्यक् कर्तुं Motioncorr 2 (43) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु, ततः CTF (contrast transfer function) पैरामीटर् निर्धारयितुं CTFFIND 4.1 (44) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु एतेषां प्रारम्भिकप्रक्रियापदार्थानाम् अनन्तरं विशिष्टानि छायासूक्ष्मचित्रं चित्रे 2. S16. स्वचालितचयन टेम्पलेट् 250-पिक्सेल-चतुष्कोणे 1000 कणानां प्रायः 250 पिक्सेलं मैन्युअल् रूपेण चयनं कृत्वा उत्पद्यते तथा च सन्दर्भ-द्वि-आयामी (2D) वर्गीकरणं नास्ति, तस्मात् तेषां वर्गीकरणानां अङ्गीकारः भवति ये नमूना-दूषणं पूरयन्ति अथवा येषां कोऽपि भेद्य-लक्षणः नास्ति ततः सर्वेषु सूक्ष्मचित्रेषु स्वचालितचयनं कृतम्, आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू ८४९,३५९ कणाः, आरसी-एलएच११६ परिसरः ४७६,५४७ कणाः च आसन् सर्वेषां चयनितकणानां गैर-सन्दर्भ-2D वर्गीकरणस्य द्वौ दौरौ कृतौ, तथा च प्रत्येकस्य धावनस्य अनन्तरं, कार्बनक्षेत्रं, नमूना-दूषणं, कोऽपि स्पष्टविशेषताः वा दृढतया आच्छादित-कणानां सङ्गतिं कुर्वन्तः कणाः अङ्गीकृताः भवन्ति, यस्य परिणामेण 772,033 (90.9%) तथा 359,678 (75.5%) ) कणानां उपयोगः 3D वर्गीकरणार्थं भवति क्रमशः आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू तथा आरसी-एलएच११६। प्रारम्भिकं 3D सन्दर्भप्रतिरूपं स्टोचैस्टिक ढाल अवरोहणपद्धतेः उपयोगेन उत्पन्नम् । प्रारम्भिकप्रतिरूपस्य सन्दर्भरूपेण उपयोगेन चयनितकणानां वर्गीकरणं 3D मध्ये चतुर्णां वर्गेषु भवति । अस्मिन् वर्गे मॉडलस्य उपयोगेन सन्दर्भरूपेण, बृहत्तमवर्गे कणानां उपरि 3D परिष्करणं कुर्वन्तु, ततः विलायकक्षेत्रं आच्छादयितुं प्रारम्भिकं 15Å लो-पास-छिद्रकस्य उपयोगं कुर्वन्तु, 6 पिक्सेल-मृदु-धाराः योजयन्तु, तथा च शीर्ष-डिटेक्टरस्य Gatan K2 peak Modulation transfer-कार्यं सम्यक् कर्तुं पिक्सेल-उत्तर-संसाधं कुर्वन्तु RC-LH114-W आँकडासमूहस्य कृते, मास्कस्य किनारेषु प्रबलघनत्वं (UCSF Chimera मध्ये कोरजटिलघनत्वात् विच्छिन्नं) निष्कास्य एतत् प्रारम्भिकं प्रतिरूपं परिवर्तितम् परिणामी मॉडल् (RC-LH114-W तथा RC-LH116 इत्येतयोः संकल्पाः क्रमशः 3.91 तथा 4.16 Å सन्ति) 3D वर्गीकरणस्य द्वितीयचक्रस्य सन्दर्भरूपेण उपयुज्यन्ते प्रयुक्ताः कणाः आरम्भिक-3D-वर्गे समूहीकृताः सन्ति, तेषु समीपस्थेन सह दृढः सहसंबन्धः नास्ति । स्पष्टसंरचनात्मकविशेषतानां अतिव्याप्तिः अथवा अभावः। 3D वर्गीकरणस्य द्वितीयपरिक्रमस्य अनन्तरं सर्वाधिकं रिजोल्यूशनयुक्तं वर्गं चयनितम् [RC-LH114-W कृते एकः वर्गः 377,703 कणाः (44.5%), RC-LH116 कृते, द्वौ वर्गौ स्तः, कुलम् 260,752 कणाः (54.7%) , यत्र ते केवलं तदा समानाः भवन्ति यदा प्रारम्भिकभ्रमणस्य अनन्तरं अल्पान्तरेण संरेखिताः भवन्ति चयनितकणाः पुनः ४००-पिक्सेल-पेटिकायां निष्कास्य 3D-शुद्धिकरणेन परिष्कृताः भवन्ति । विलायकमास्कः प्रारम्भिकस्य १५Å लो-पास-छिद्रकस्य, ३ पिक्सेल-नक्शा-विस्तारस्य, ३ पिक्सेल-सॉफ्ट-मास्कस्य च उपयोगेन उत्पद्यते । प्रति-कण-सीटीएफ-परिष्कारस्य उपयोगेन, प्रति-कण-गति-सुधारस्य च प्रति-कण-सीटीएफ-परिष्कारस्य द्वितीय-परिक्रमस्य उपयोगेन, परिणामित-बनावटं अधिकं परिष्कृत्य प्रत्येकस्य चरणस्य अनन्तरं 3D-परिष्कारः, विलायक-मास्किंग्, उत्तर-प्रक्रियाकरणं च क्रियते 0.143 इत्यस्य FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) कट-ऑफ-मूल्यं उपयुज्य RC-LH114-W तथा RC-LH116 इत्येतयोः अन्तिम-माडलयोः रिजोल्यूशनं क्रमशः 2.65 तथा 2.80Å भवति अन्तिमप्रतिरूपस्य FSC वक्रं चित्रे 2. S17 दर्शितम् अस्ति।
सर्वे प्रोटीन अनुक्रमाः UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5) इत्यस्मात् डाउनलोड् भवन्ति; LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); आर सी-एल (PufL; UniProt आईडी: O83005); आर सी-एम (PufM; UniProt आईडी: A0A4Z7); आर सी-एच (PuhA; UniProt आईडी: A0A4Z9); प्रोटीन-डब्ल्यू (PufW; UniProt आईडी: Q6N1K3)। SWISS-MODEL (45) इत्यस्य उपयोगः आरसी इत्यस्य समरूपताप्रतिरूपस्य निर्माणार्थं कृतः, यस्मिन् आरसी-एल, आरसी-एम तथा आरसी-एच इत्येतयोः प्रोटीन अनुक्रमाः आरबीए इत्यस्य स्फटिकसंरचना च सन्ति sphaeroides RC इत्यस्य उपयोगः टेम्पलेट् (PDB ID: 5LSE) (46) इत्यस्य रूपेण कृतः । UCSF Chimera इत्यस्मिन् “fit map” उपकरणस्य उपयोगं कृत्वा उत्पन्नं मॉडलं मानचित्रे (47) फिट् कर्तुं, प्रोटीनसंरचनायां सुधारं कुर्वन्तु, तथा च सहकारकं कुर्वन्तु [4×BChl a (मोनोमर पुस्तकालय अवशेषनाम = BCL), 2×BPh a (BPH), एक वा द्वौ प्रकारौ UQ10 (U10), एकं गैर-हीम लोहं (Fe) एकं 3,4-डाइहाइड्रोहेक्साकार्बोनिल्कोलाइनं च (QAK)] योजयितुं Coot (48) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्ति । यतः QAK मोनोमर पुस्तकालये उपलब्धं नास्ति, अतः PHENIX (49) इत्यस्मिन् eLBOW उपकरणस्य उपयोगेन तस्य पैरामीटराइज्ड् कृतम् ।
तदनन्तरं LH1 उप-एककस्य निर्माणं कृतम् । प्रारम्भे PHENIX (49) इत्यस्मिन् स्वचालितनिर्माणसाधनस्य उपयोगः नक्शायाः उपयोगेन LH1-अनुक्रमस्य भागस्य स्वचालितरूपेण निर्माणार्थं तथा च LH1-α तथा LH1-β प्रोटीन-अनुक्रमस्य निवेशरूपेण उपयुज्यते स्म अत्यन्तं सम्पूर्णं LH1 उप-एककं चयनं कृत्वा, तत् निष्कास्य Coot मध्ये लोड् कुर्वन्तु, तस्मिन् अनुपलब्धं अनुक्रमं मैन्युअल् रूपेण योजयन्तु, तथा च द्वौ BCls a (BCL) तथा एकं spirilloxanthin (CRT) योजयितुं पूर्वं सम्पूर्णं संरचनां मैन्युअल् रूपेण परिष्कृतं कुर्वन्तु [सम्बद्ध Rps इत्यस्य अनुसारं LH1 परिसरस्य घनत्वं ज्ञातं च कैरोटीनोइड् सामग्री जाति (17)] । सम्पूर्णं LH1 उप-एककं प्रतिलिपिं कुर्वन्तु, तथा च LH1 घनत्वस्य समीपस्थे गैर-मॉडेल् क्षेत्रे डॉक् कर्तुं UCSF Chimera “Docking Map Tool” इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु, ततः Coot इत्यत्र परिष्कृतं कुर्वन्तु; यावत् सर्वेषां LH1 उप-एककानां प्रतिरूपणं न भवति तावत् प्रक्रियां पुनः कुर्वन्तु । RC-LH114-W संरचनायाः कृते, Coot इत्यस्मिन् अनावंटितघनत्वं निष्कास्य, USCF Chimera मानचित्रे अवशिष्टेभ्यः गैर-प्रोटीनघटकेभ्यः प्रोटीनस्य खण्डीकरणं भवति तथा च Autobuild उपकरणस्य उपयोगः प्रारम्भिकप्रतिरूपस्य स्थापनायै भवति, तथा च अवशिष्टानां उप-एककानां (protein-W) Modeling इत्यस्य उपयोगः भवति PHENIX (49) इत्यत्र । Coot (48) इत्यस्मिन् परिणामी मॉडल् मध्ये यत्किमपि अनुपलब्धं अनुक्रमं योजयन्तु, ततः सम्पूर्णं उप-एककं मैन्युअल् रूपेण परिष्कृतं कुर्वन्तु । शेषं अनावंटितं घनत्वं लिपिड्स् (CDL = CDL, POPC = 6PL तथा POPG = PGT), β-DDM डिटर्जन्ट (LMT) तथा UQ10 अणु (U10) इत्येतयोः संयोजनेन सह फिट् भवति सम्पूर्णं प्रारम्भिकं प्रतिरूपं सिद्धं कर्तुं Coot (48) इत्यस्मिन् PHENIX अनुकूलनस्य (49) तथा मैनुअल् अनुकूलनस्य उपयोगं कुर्वन्तु यावत् मॉडलस्य आँकडानां तथा फिट् इत्यस्य दृश्यगुणवत्तायां अधिकं सुधारः न भवति। अन्ते, स्थानीयनक्शां तीक्ष्णं कर्तुं LocScale (50) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु, ततः अनावंटितघनत्वस्य प्रतिरूपणं स्वचालितं मैनुअल् च अनुकूलनं च अन्येषां कतिपयानां चक्राणां कार्यं कुर्वन्तु
स्वस्वघनत्वस्य अन्तः डॉक् कृताः तत्तत् पेप्टाइड्, कोफैक्टर् इत्यादयः लिपिड्-क्विनोन्-चित्रेषु 1 तथा 2. S18 तः S23 पर्यन्तं दर्शिताः सन्ति अन्तिमप्रतिरूपस्य सांख्यिकीयसूचना सारणी S1 मध्ये दर्शिता अस्ति।
अन्यथा निर्दिष्टं न भवति चेत्, UV/Vis/NIR अवशोषणवर्णक्रमाः Cary60 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् (Agilent, USA) इत्यत्र 250 nm तः 1000 nm पर्यन्तं 1 nm अन्तरालेषु 0.1s एकीकरणसमये च एकत्रिताः आसन्
नमूनां क्वार्ट्ज क्यूवेट् इत्यस्मिन् १ इत्यस्य A880 यावत् २ मि.मी.मार्गेण पतला कुर्वन्तु, तथा च ४०० तः १००० एनएम यावत् अवशोषणवर्णक्रमं संग्रहयन्तु । वृत्ताकारद्विवर्णीयवर्णक्रमाः जास्को ८१० स्पेक्ट्रोपोलारिमीटर् (जास्को, जापान) इत्यत्र ४०० एनएमतः ९५० एनएमपर्यन्तं १ एनएम अन्तरालेषु २० एनएम मिन्-१ स्कैनदरेण एकत्रिताः आसन्
मोलर विलुप्तता गुणांकः कोर परिसरं प्रायः 50 इत्यस्य A880 यावत् पतला कृत्वा निर्धारितः भवति प्रत्येकस्य मेथनॉल-नमूनायाः BChl-सामग्री 54.8 mM-1 cm-1 इत्यस्य 771 nm इत्यत्र विलुप्ततागुणकेन गणिता, विलुप्ततायाः गुणांकः च निर्धारितः (51) कोर जटिलसान्द्रतां निर्धारयितुं मापितां BChl सान्द्रतां 32 (RC-LH114-W) अथवा 36 (RC-LH116) इत्यनेन विभज्य ततः बफर विलुप्तता गुणांके एकत्रितस्य समानस्य नमूनायाः अवशोषणवर्णक्रमस्य निर्धारणाय उपयुज्यते समानांतर। प्रत्येकं नमूनायाः कृते त्रीणि पुनः पुनः मापनं कृतम्, गणनायै च BChl Qy अधिकतमस्य औसतशोषणस्य उपयोगः कृतः । ८७८ एनएम इत्यत्र मापितस्य आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू इत्यस्य विलुप्ततागुणकः ३२८०±१४० एमएम-१ सेमी-१, यदा तु ८८० एनएम इत्यत्र मापितस्य आरसी-एलएच११६ इत्यस्य विलुप्ततागुणकः ३८००±३० एमएम-१ सेमी-१ अस्ति
UQ10 इत्यस्य परिमाणं (52) इत्यस्मिन् पद्धत्यानुसारं कृतम् । संक्षेपेण एजिलेण्ट् १२०० एचपीएलसी प्रणाल्याः उपयोगेन रिवर्स फेज एचपीएलसी (RP-HPLC) इति कार्यं कृतम् । 0.02% (w/v) फेरिकक्लोराइड् युक्तस्य 50:50 मेथनॉल:क्लोरोफॉर्मस्य 50μl इत्यस्मिन् RC-LH116 अथवा RC-LH114-W इत्यस्य प्रायः 0.02 nmol विलीनं कुर्वन्तु, तथा च पूर्व-संतुलितं Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm HPLC इत्यत्र 40°C इत्यत्र 1 ml-1 min-1 इत्यस्मिन् विलीनं कुर्वन्तु ×25 सेमी स्तम्भे विलायक (80:20 मेथनॉल:2-प्रोपानोल्) । 275 एनएम (UQ10), 450 एनएम (कैरोटीनोइड्स) तथा 780 एनएम (BChl) इत्यत्र 1 घण्टापर्यन्तं अवशोषणस्य निरीक्षणार्थं एचपीएलसी विलायकस्य समरूपी इल्यूशनं कुर्वन्तु। २५.५ निमेषेषु २७५ एनएम क्रोमैटोग्रामे शिखरं एकीकृतम् आसीत्, यस्मिन् अन्ये केचन ज्ञातुं शक्याः यौगिकाः न आसन् । एकीकृतक्षेत्रस्य उपयोगः 0 तः 5.8 nmol पर्यन्तं शुद्धमानकानां इन्जेक्शनात् गणितस्य मापनवक्रस्य सन्दर्भेण निष्कासितस्य UQ10 इत्यस्य मोलरमात्रायाः गणनाय भवति (चित्रं S14) प्रत्येकं नमूना त्रिषु प्रतिकृतेषु विश्लेषितं, तथा च निवेदितः त्रुटिः औसतस्य SD इत्यनेन सह सङ्गच्छते ।
0.1 अधिकतम Qy अवशोषणयुक्तं RC-LH1 परिसरं युक्तं घोलं 30 μM न्यूनीकृत अश्वहृदयसाइटोक्रोम c2 (Merck, UK) तथा 0 तः 50 μMUQ2 (Merck, UK) इत्यनेन सह निर्मितम् प्रत्येकं UQ2 सान्द्रतायां त्रीणि 1-ml नमूनानि निर्मिताः, मापनात् पूर्वं अन्धकारे पूर्णतया अनुकूलनं सुनिश्चित्य 4°C इत्यत्र अन्धकारे रात्रौ यावत् इन्क्यूबेट् कृतवन्तः। समाधानं OLIS RSM1000 मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर् इत्यस्मिन् 300 एनएम ज्वाला/500 रेखाजालम्, 1.24 मि.मी.प्रवेशः, 0.12 मि.मी.मध्यं, 0.6 मि.मी.निर्गमस्लिट् इत्यनेन सुसज्जितं भारितम् आसीत् उत्तेजनाप्रकाशं बहिष्कृत्य नमूनाप्रकाशनलिकेः सन्दर्भप्रकाशगुणकस्य च प्रवेशद्वारे ६०० एनएम दीर्घपास्-छिद्रकं स्थापितं भवति । 0.15 s एकीकरणसमयेन 550 nm इत्यत्र अवशोषणस्य निरीक्षणं कृतम् । उत्तेजनाप्रकाशः 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) इत्यस्मात् DC2200 नियन्त्रकस्य (Thorlabs Ltd., UK) इत्यस्य माध्यमेन 90% तीव्रतायां फाइबर ऑप्टिक केबलद्वारा उत्सर्जितः भवति तथा च प्रकाशस्रोते 90° of. मापनपुञ्जः दर्पणस्य विरुद्धं भवति यत् यत्किमपि प्रकाशं प्रारम्भे नमूनेन अवशोषितं नासीत् तत् प्रत्यागन्तुं भवति । 50 s प्रकाशस्य 10 s पूर्वं शोषणस्य निरीक्षणं कुर्वन्तु। ततः अन्धकारे 60 s यावत् अवशोषणस्य अग्रे निरीक्षणं कृतम् यत् क्विनोलोल् स्वतः एव साइटोक्रोम c23 + कियत्पर्यन्तं न्यूनीकरोति इति आकलनं कृतम् (कच्चा आँकडानां कृते चित्रं S8 पश्यन्तु)।
0.5 तः 10 s (UQ2 सान्द्रतायाः आधारेण) रेखीयप्रारम्भिकदरं फिट् कृत्वा प्रत्येकस्मिन् UQ2 सान्द्रतायां त्रयाणां नमूनानां दरानाम् औसतं कृत्वा आँकडानां संसाधनं कृतम् तत्तत् विलुप्तगुणगुणकेन गणितस्य आरसी-एलएच१ सान्द्रतायाः उपयोगः दरं उत्प्रेरकदक्षतायां परिवर्तयितुं, Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) इत्यस्मिन् प्लॉट् कृत्वा, प्रतीयमानं Km तथा Kcat मूल्यं निर्धारयितुं Michaelis-Menten मॉडले फिट् कृतम्
क्षणिक अवशोषणमापनार्थं RC-LH1 नमूना 50 mM सोडियम एस्कॉर्बेट् (Merck, USA) तथा 0.4 mM Terbutin (Merck, USA) युक्ते IMAC बफरमध्ये ~2μM यावत् पतलाः कृतः एस्कॉर्बिक अम्लस्य उपयोगः बलिदानीय इलेक्ट्रॉनदातृरूपेण भवति, तथा च tert-butaclofen इत्यस्य उपयोगः QB अवरोधकरूपेण भवति यत् एतत् सुनिश्चितं भवति यत् मुख्यः RC दाता सम्पूर्णे मापनप्रक्रियायां न्यूनीकृतः (अर्थात् प्रकाश-आक्सीकृतः न) तिष्ठति लेजरमार्गे स्थितस्य नमूनायाः उत्तेजनानाडीनां मध्ये अन्धकारानुकूलनस्य कृते पर्याप्तः समयः भवति इति सुनिश्चित्य २ मि.मी. 1 kHz (NIR कृते 20 nJ अथवा Vis कृते 100 nJ) पुनरावृत्तिदरेण 880 nm इत्यत्र नमूना उत्तेजितुं Ti: Sapphire लेजर प्रणालीं (Spectra Physics, USA) प्रवर्धयितुं ~100-fs लेजर स्पन्दनानां उपयोगं कुर्वन्तु दत्तांशसङ्ग्रहात् पूर्वं नमूना प्रायः ३० निमेषान् यावत् उत्तेजनाप्रकाशे स्थापयन्तु । संपर्कात् QA निष्क्रियीकरणं भविष्यति (संभवतः QA एकवारं द्वौ वा न्यूनीकरोति)। परन्तु कृपया ज्ञातव्यं यत् एषा प्रक्रिया प्रतिवर्तनीया अस्ति यतोहि दीर्घकालं यावत् अन्धकारानुकूलनस्य अनन्तरं आरसी धीरे धीरे QA क्रियाकलापं प्रति प्रत्यागमिष्यति। -10 तः 7000 ps यावत् विलम्बसमयेन क्षणिकस्पेक्ट्रामापनार्थं हेलिओस् स्पेक्ट्रोमीटर् (Ultrafast Systems, USA) इत्यस्य उपयोगः कृतः । आँकडासमूहान् विसमूहयितुं, ततः विलीनीकरणाय, मानकीकरणाय च Surface Xplorer सॉफ्टवेयर (Ultrafast Systems, USA) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । क्षयसम्बद्धं विभेदकवर्णक्रमं प्राप्तुं संयुक्तदत्तांशसमूहस्य उपयोगाय CarpetView सॉफ्टवेयरसङ्कुलस्य (Light Conversion Ltd., Lithuania) उपयोगं कुर्वन्तु, अथवा Origin (OriginLab, USA) इत्यस्मिन् एकतरङ्गदैर्घ्यवर्णक्रमविकासं फिट् कर्तुं यन्त्रप्रतिक्रियायाः सह बहुघटकं संयोजयति इति कार्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु
यथा उपरि उक्तं (५३) आरसी तथा परिधीय एलएच२ एंटीना इत्येतयोः अभावयुक्तं LH1 परिसरं युक्तं प्रकाशसंश्लेषणं चलच्चित्रं निर्मितम् । झिल्लीं 20 mM tris (pH 8.0) इत्यस्मिन् क्षीणं कृत्वा ततः 2 mm प्रकाशीयमार्गेण सह क्वार्ट्ज-क्यूवेट्-मध्ये भारितम् । -१० तः ७००० ps यावत् विलम्बसमयेन ५४० एनएम इत्यत्र नमूना उत्तेजितुं ३०nJ लेजर स्पन्दनस्य उपयोगः कृतः । Rps कृते यथा वर्णितं तथा दत्तांशसमूहं संसाधयन्तु। पाल नमूना।
झिल्लीं 150,000 RCF इत्यत्र 4°C इत्यत्र 2 घण्टापर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणेन गोलीकृतं, ततः 880 nm इत्यत्र तस्य अवशोषणं 20 mM tris-HCl (pH 8.0) तथा 200 mM NaCl इत्यत्र पुनः निलम्बितम् 2% (w/v) β-DDM इत्यस्मिन् 4°C इत्यत्र अन्धकारे 1 घण्टां यावत् धीरेण हलचलं कृत्वा झिल्लीं विलीनं कुर्वन्तु। नमूना 100 mM ट्राइएथिल अमोनियम कार्बोनेट् (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) इत्यस्मिन् 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad विश्लेषण) प्रोटीनसान्द्रतायां पतलाः कृतः पूर्वं प्रकाशितपद्धत्या (54) अग्रे प्रसंस्करणं कृतम्, 50 μg प्रोटीनस्य पतलाकरणेन आरभ्य कुल 50 μl TEAB मध्ये 1% (w/v) सोडियम लौरेट् (Merck, UK) युक्तम् 60 s कृते sonication अनन्तरं, 30 मिनिट् यावत् 37 ° C मध्ये 5 mM tris (2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) सह न्यूनीकृतम् आसीत्। S-alkylation कृते नमूना 10 mM मिथाइल S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) इत्यनेन सह इन्क्यूबेट् कृत्वा 200 mM आइसोप्रोपानोल स्टॉक घोलात् कक्षतापमाने 10 मिनिट् यावत् योजयन्तु प्रोटीओलाइटिक पाचनं 2 μg ट्रिप्सिन्/एन्डोप्रोटीनेज Lys-C मिश्रणं (Promega UK) योजयित्वा 37°C मध्ये 3 घण्टापर्यन्तं इन्क्यूबेट् कृतम्। लौरेट् पृष्ठसक्रियकं 50 μl एथिल एसीटेट् तथा 10 μl 10% (v/v) LC ग्रेड ट्राइफ्लोरोएसिटिक अम्ल (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) योजयित्वा 60 s यावत् भंवरं कृत्वा निष्कासितम्। चरणपृथक्करणं १५,७०० आरसीएफ इत्यत्र ५ निमेषपर्यन्तं अपकेन्द्रीकरणेन प्रवर्धितम् । निर्मातुः प्रोटोकॉलस्य अनुसारं पेप्टाइड् युक्तं निम्नचरणं सावधानीपूर्वकं आस्पिरेट् कृत्वा लवणं विमुक्तं कर्तुं C18 स्पिन् स्तम्भस्य (Thermo Fisher Scientific, UK) उपयोगः कृतः वैक्यूम अपकेन्द्रीकरणेन शुष्कीकरणानन्तरं नमूना 0.5% TFA तथा 3% एसीटोनिट्राइलमध्ये विलीनं कृतम्, तथा च पूर्वं विस्तृतप्रणालीमापदण्डानां उपयोगेन द्रव्यमानवर्णक्रममापनेन सह युग्मितेन नैनोफ्लो आरपी क्रोमैटोग्राफीद्वारा 500 ng विश्लेषणं कृतम्
Rps इत्यस्य अन्वेषणार्थं प्रोटीनपरिचयस्य परिमाणनिर्धारणाय च MaxQuant v.1.5.3.30 (56) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु । palustris प्रोटीओम डाटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीओमिक्स-आँकडाः PRIDE भागीदार-भण्डारस्य (http://proteomecentral.proteomexchange.org) इत्यस्य माध्यमेन ProteomeXchange Alliance इत्यस्मिन् आँकडा-समूह-परिचय-कर्ता PXD020402 इत्यस्य अन्तर्गतं निक्षिप्ताः सन्ति
विद्युत्स्प्रे आयनीकरण द्रव्यमानवर्णक्रममापनेन सह युग्मित आरपीएलसी द्वारा विश्लेषणार्थं वन्यप्रकारस्य आरपीएसतः आरसी-एलएच१ परिसरं निर्मितम् आसीत् । पूर्वं प्रकाशितपद्धतेः (16) उपयोगेन, पलुस्ट्रिसकोशिकासु उत्पादिता प्रोटीनसान्द्रता 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl तथा 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM इत्यस्मिन् 2 mg ml-1 आसीत् निर्मातुः प्रोटोकॉलस्य अनुसारं अवक्षेपणपद्धत्या 10 μg प्रोटीनं निष्कासयितुं 2D शुद्धिकरणकिट् (GE Healthcare, USA) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु, अवक्षेपं च 20 μl 60% (v / v) फॉर्मिक अम्लम् (FA), 20% (v / v) एसीटोनिट्राइल तथा 20% (v/v) जलेषु विलीनं कुर्वन्तु। पञ्च माइक्रोलीटरस्य विश्लेषणं आरपीएलसी (Dionex RSLC) द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (Maxis UHR-TOF, Bruker) इत्यनेन सह युग्मितेन कृतम् । 60°C तथा 100μlmin -1 इत्यत्र पृथक्करणार्थं MabPac 1.2×100 mm स्तम्भस्य (Thermo Fisher Scientific, UK) इत्यस्य उपयोगं कुर्वन्तु, यत्र 85% (v / v) विलायक A [0.1% (v / v) FA तथा 0.02% (V/v) TFA जलीय घोल] तः 85%(v/v) विलायक B पर्यन्तं ढालः भवति [90%(v/v) एसीटोनिट्राइल TFA इत्यस्मिन् 0.1%(v/v) FA तथा 0.02%(v/v)] 60 मिनिट् अधिकं यावत् मानकविद्युत्स्प्रे आयनीकरणस्रोतस्य पूर्वनिर्धारितमापदण्डानां च उपयोगेन द्रव्यमानवर्णक्रममापकः 100 तः 2750 m/z (द्रव्यमान-आभार-अनुपातः) यावत् प्राप्नोति ExPASy bioinformatics resource portal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/) इत्यस्य साहाय्येन, परिसरस्य उप-इकायानां कृते जन-वर्णक्रमस्य नक्शाङ्कनं कुर्वन्तु ।
कोशिकानां 100 मिलीलीटर NF-कम (10μMm-2 s-1), मध्यम (30μMm-2 s-1) अथवा उच्च (300μMm-2 s-1) प्रकाशस्य अन्तर्गतं 72 घण्टापर्यन्तं वर्धितम्। M22 माध्यमं (M22 माध्यमं यस्मिन् अमोनियमसल्फेट् परित्यक्तं भवति तथा च सोडियमसुक्सिनेट् सोडियम एसिटेट् इत्यनेन प्रतिस्थापितं भवति) 100 ml स्क्रू-टॉप् बोतले (23) पञ्चसु ३०-s चक्रेषु ०.१ माइक्रोन् काचस्य मणिः १:१ आयतनानुपातेन मणिबन्धेन कोशिकानां विच्छेदनं कृत्वा ५ निमेषपर्यन्तं हिमे शीतलीकरणं कृतम् अघुलनशीलं पदार्थं, अखण्डकोशिकाः, काचस्य मणिः च बेन्चटॉप् माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज् इत्यस्मिन् १० निमेषपर्यन्तं १६,००० आरसीएफ इत्यत्र अपकेन्द्रीकरणेन निष्कासिताः झिल्लीं 40/15% (w/w) सुक्रोज ढालेन सह 20 mM tris-HCl (pH 8.0) इत्यस्मिन् 100,000 RCF इत्यनेन सह Ti 70.1 रोटर इत्यस्मिन् 10 घण्टापर्यन्तं पृथक् कृता
यथा अस्माकं पूर्वकार्य्ये वर्णितं, PufW (16) इत्यत्र His टैगस्य प्रतिरक्षापरिचयः । संक्षेपेण, शुद्धं कोर परिसरं (11.8 nM) अथवा 2x SDS लोडिंग बफर (Merck, UK) इत्यस्मिन् RC इत्यस्य समानसान्द्रतायुक्ता झिल्ली (कमकृतं अन्तरवर्णक्रमं घटयित्वा आक्सीकरणेन निर्धारितं तथा च रंगीनजेलस्य उपरि भारस्य मेलनं कृत्वा) द्विवारं पतला कृता प्रोटीनानि प्रतिकृते १२% बिस्-ट्रिस् NuPage जेल् (Thermo Fisher Scientific, UK) इत्यनेन पृथक् कृताः । आरसी-एल उप-एककं लोड् कर्तुं दृश्यमानं च कर्तुं कूमासी ब्रिलियण्ट् ब्लू (बायो-रैड्, यूके) इत्यनेन एकं जेल् रङ्गितम् । द्वितीयजेलस्य प्रोटीनं प्रतिरक्षापरीक्षायै मेथनॉल-सक्रिय-पॉलीविनाइलडीन-फ्लोराइड् (PVDF) झिल्ली (Thermo Fisher Scientific, UK) इत्यत्र स्थानान्तरितम् PVDF झिल्लीं 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 तथा 5% (w / v) स्किम्ड दुग्धचूर्णे अवरुद्धं कृत्वा, ततः anti-His प्राथमिकप्रतिपिण्डेन (in Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6)) इत्यनेन सह इन्क्यूबेट् कृतम् 150 mM NaCl तथा 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) इत्यस्मिन् 4 घण्टां यावत् । प्रतिपिण्डबफरमध्ये ५ मिनिट् यावत् ३ वारं प्रक्षालनस्य अनन्तरं झिल्लीं हॉर्सरैडिश पेरोक्साइडेज (Sigma-Aldrich, UK) एण्टी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी (एण्टीबॉडी बफरमध्ये १:१०,००० पतला) सह संयोजितवती यत् WESTAR ETA C २.० रसायनप्रकाशसब्स्ट्रेट् इत्यस्य उपयोगेन पत्ताङ्गीकरणं (प्रतिपिण्डबफरमध्ये ३ प्रक्षालनानन्तरं ५ मिनिट् अनन्तरं) इन्क्यूबेट् करणीयम् (Cyanagen, Italy) तथा Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK) इति ।
प्रत्येकस्य रंगीन जेलस्य अथवा इम्यूनोएसे लेनस्य तीव्रतावितरणं आकर्षयित्वा, शिखरस्य अधः क्षेत्रं एकीकृत्य तथा च आरसी-एल (रंगित जेल) तथा प्रोटीन-डब्ल्यू (इम्यूनोएसे) इत्यस्य तीव्रता अनुपातस्य गणनां कृत्वा, इमेजजे (57) इत्यस्मिन् इमेजे प्रक्रियां कुर्वन्तु। शुद्ध-आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू नमूने आरसी-एल-प्रोटीन-डब्ल्यू-प्रति अनुपातः १:१ इति कल्पयित्वा तदनुसारं सम्पूर्णं आँकडा-समूहं सामान्यीकृत्य एतेषां अनुपातानाम् मोल-अनुपातयोः परिवर्तनं कृतम्
अस्य लेखस्य पूरकसामग्रीणां कृते कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 पश्यन्तु
एषः क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन अनुज्ञापत्रस्य शर्तानाम् अन्तर्गतं वितरितः मुक्तप्रवेशलेखः अस्ति । लेखः मूलकृतिः सम्यक् उद्धृतः इति शर्तेन कस्मिन् अपि माध्यमे अप्रतिबन्धितप्रयोगं, वितरणं, पुनरुत्पादनं च अनुमन्यते ।
नोटः- वयं केवलं भवन्तं भवतः ईमेल-सङ्केतं प्रदातुम् याचयामः येन भवन्तः पृष्ठे अनुशंसिताः व्यक्तिः ज्ञास्यति यत् भवन्तः इच्छन्ति यत् ते ईमेल-पत्रं द्रष्टुम् इच्छन्ति तथा च एतत् स्पैम् नास्ति इति। वयं किमपि ईमेल-सङ्केतं न गृह्णीमः ।
एषः प्रश्नः भवान् आगन्तुकः अस्ति वा इति परीक्षितुं स्वयमेव स्पैम-प्रदानं निवारयितुं च उपयुज्यते ।
डेविड जे के Swainsbury, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम Faries, Dariusz एम Niedzwiedzki, एलिजाबेथ सी मार्टिन, डेविड ए किसान, Lorna ए मेलोन, रेबेका एफ थॉम्पसन, नील ए Ranson, डैनियल पी Canniffe , मार्क जे Dickman, Dewey Holten, क्रिस्टीन Kirmaier, एंड्रयू Hitchcock, सी नील हंटर
प्रतिक्रियाकेन्द्रे प्रकाशजाल १ परिसरस्य उच्चसंकल्पसंरचना क्विनोनगतिविज्ञानस्य नूतनानि अन्वेषणं प्रदाति ।
डेविड जे के Swainsbury, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम Faries, Dariusz एम Niedzwiedzki, एलिजाबेथ सी मार्टिन, डेविड ए किसान, Lorna ए मेलोन, रेबेका एफ थॉम्पसन, नील ए Ranson, डैनियल पी Canniffe , मार्क जे Dickman, Dewey Holten, क्रिस्टीन Kirmaier, एंड्रयू Hitchcock, सी नील हंटर
प्रतिक्रियाकेन्द्रे प्रकाशजाल १ परिसरस्य उच्चसंकल्पसंरचना क्विनोनगतिविज्ञानस्य नूतनानि अन्वेषणं प्रदाति ।
©2021 अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द एडवांसमेण्ट् आफ् साइंस। सर्वे अधिकाराः सुरक्षिताः। एएएएस HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef तथा COUNTER इत्येतयोः भागीदारः अस्ति । विज्ञान उन्नति ISSN 2375-2548.